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コロニーダイレクトPCRって 名前: 名無しさん

1 :名無しさん :02/02/09 23:16
コロニーダイレクトPCRって当てになるの?
前回はうまくいったけど、今回のインサートの場合
結果は全部ネガティブ。インサートが入ってないとは
思えない。ちなみにベクターはBLUESCRIPT、プライマーは
T3、T7なのですが・・・

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 23:18
あなたの腕が悪いという可能性は?

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 23:19
ちょこっとだけよ、かきとるの。
かきとるっていうか、チョンとつつくだけ。

4 :1です:02/02/09 23:22
>2
腕が悪いなら、何が問題なんでしょうか。
以前はうまくいったのですが、何か忘れたポイントが
あるのかなあ。

>3
それって、たくさんいれると正確なバンドがでないってこと
ですか?

5 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/09 23:27
ポジコンは?

6 :1です:02/02/09 23:29
スレッド立てたとたんレスがついてうれしですが、
誰もうまくいかなかった経験ないみたいですね・・・

7 : :02/02/09 23:34
てゆうかポジコン・ネガコンぐらいちゃんとやりなさい。
それで出なけりゃ入ってないの!

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 00:00
>3
何故かバンド自体出ないのよ。

9 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 00:03
滅菌した楊枝なんかでチョンってつつくだけ。
触ったかな?くらいでOK。

10 :>8:02/02/10 01:09
すごく短いバンドはでます。これもコロニー入れすぎの
影響かなあ。

あと、値が今は大丈夫でした。ポジはいれませんでした・・・

11 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 01:28
インサートが入ってないと思えないなら、
ミニプレして確かめたらいいんじゃないですか?

12 :>11:02/02/10 01:32
今晩開始しました。

13 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 02:49
T7&T3 prierの組み合わせはあかんよ
M13の組み合わせにすればコロピーは簡単

14 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 03:06
>>13
T3T7でもうまくいきますよ。

15 :1です。:02/02/10 04:02
もしかしたらinsertを組み込んだ位置からのプライマー
結合部位までの距離なんてのも関係あるかもしれないので
M13でも試してみようかな。

16 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 04:05
俺は爪楊枝で付いた後に、さらに滅菌水で軽くすすいでからPCRにかける。
バンドはきれい。

17 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 04:53
確かにT3とT7の認識配列が似てるためPCRが少しだけ
難しくなるので、自信がないとM13が安全かも。
漏れは、コロニーを植菌したのち、30ulの水に菌をすすいで
3分90度ぐらいで処理して、軽くスピンして上澄を1ul
使ってます。

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 07:16
>16, 17 sonna mendo-kusai koto yatteru no?

Direct-PCR

Point: MUST use AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer/Applied Biosystems)
Do not use Pfu polymerase (Stratagene)
Successful rate- AmpliTaq: >95%
Pfu: 0-30%

Reaction: 20 ml/sample
6 samples 11 samples 16 samples 32 samples
dd.H2O 107 ul 196.6 ul 86.2 ul 572.4 ul
DMSO 6.8 2.4 18 36
10x buffer 13.5 24.8 36 72
Upper primer (200 ng/ml) 1.7 3.1 4.5 9
Lower primer (200 ng/ml) 1.7 3.1 4.5 9
10 mM dNTP 2.7 5 7.2 14.4
AmpliTaq (5 U/ul) 1.4 2.5 3.6 7.2
total 134.8 247.5 360 720

Split 20 ul to each tube. Take colony with tip and transfer E.coli to PCR solution (just rince tip in PCR solution) and then inoculate number-labeled LB-antibiotics plate with same tip.

PCR
94 OC, 2 min
94 OC, 1 min
55 OC, 1 min x 30 cycles
72 OC, 2-4 kb/min
4 OC, ∞

Electrophoresis
Add 2 ml of 10x dye and apply all volume (ca. 22 ml) to 1% agarose-0.5x TAE


19 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 07:23
>>18
Promegaの普通のTaqでもちゃんとできますよ。

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 10:38
TaKaRaの普通のTaqでもできるさ

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 11:27
腕が悪いだけです
グレードが低いtaqでも増えますよ
100個もつつけば慣れます。

あやしいならミニプレ

22 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 11:31
シグマのTaqでもフツーに出来る。
コロニーからでなく培養液からのダイレクトでも増える。

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 11:44
>>4
>腕が悪いなら、何が問題なんでしょうか。
自分でやった実験なのに、失敗原因の候補すら挙げることができないから腕が悪いと言われるのです。
実験は、失敗したら何が悪かったのかを明らかに出来るように組まなくてはなりません。
うまくいってないのに、ポジコンとってないのは最悪です。
コロニーいれすぎも失敗原因として覿面に効いてると思われますが、
インサートが入ってるかどうかも確認してないとすると、なんだかぜんぜんわかりません。

もう一度、プロトコルと自分の材料・手順を確認して、問題点を発見しましょう。

24 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 12:52
つま楊枝の中にPCR阻害物質が含まれているそうな。
TaKaRaだったかTOYOBOのカタログに書いてあった。

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 13:15
プラ楊枝なら大丈夫ってこと?

26 : :02/02/10 14:25
ところでインサートの長さってどれくらいよ?
安物Taqで2kb以上が苦しかったことあり。

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 15:41
>25
普通のパイペット用のチップ(イエロー)を使えば良い

28 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 15:45
I see.

29 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 16:13
>>24
柳のgDNAでしょ?

30 :1です:02/02/10 18:47
>26
確かに2kb近くあります。

>27
私もチップを使っています。



31 : :02/02/10 21:25
takaraのinsert check kitってどのくらい持つのかな?

全く同じプロトコールでやってるのに半年後には
全然増えなくなった。全ての反応時間を増やすと
増えるようになったが、3ヶ月後にはそれですら
増えなくなった。

32 : :02/02/10 21:38
根性 mini prep & sequence の方が早いと思われ。

33 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 22:32
1サンプル10〜15ulで、爪楊枝でかなり乱暴につついた場合(殆ど掻き取っていることもある)
でも綺麗にバンド出るけどなあ。
もっとも、DH5αのような生えるのが遅い菌を使ってるので、コロニーがまだ小さいときにやってるから
多すぎると言うことがなかっただけかもしれない。
(コロニーはPCR溶液に懸濁した爪楊枝でそのまま別プレートにストリークして確保)
使ってるのはTakara Taq。VectorはpBluescript、pCR2.1、pET19bなど。
プライマーはM13とか、T7&T3、T7&T7 terminaterで、30サイクルくらい回して、
PCR産物全部流すと凄く明るいバンドが見られる。

34 :1です:02/02/11 00:33
5mL culture & digestionでinsertが確認されました。
従って、ダイレクトコロニーPCRが動いていなかったことが
判明致しました。

自分のプロトコールで動かなかったことは初めてだし、
まさかinsertが200bpのものも2kbのものも
detectできていないなんて、予想もしませんでした。

いろいろ教えて下さったみなさんありがとうございました。
時間があったらM13でも動かないか確認してみようと思います。

35 :ハ1です:02/02/11 00:58
>18
protocol中のDMSOって必須なのでしょうか?

36 :18じゃないけど:02/02/11 01:07
DMSOなんて、入れたことないけどいつもうまくいく。

37 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 03:29
>>34
なんか、謙虚だね。

38 :>37:02/02/11 04:23
ありがとうございます。
最近生物版でいろんなことをいわれてる女性ポス毒の一人です。
いばらの道を突き進むようだね、なんていわれながら
ここまでやってきました・・・

これからもみなさんよろしくお願いします!


39 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 04:27
ポスドクに男も女もないのじゃ。
忍耐あるのみ。運が回ってきたら「リー即ツモ裏ドラ5」
みたいなのもあるかもしれんし。

>35
DMSOはインサートにGCが多い時に効くことがあります。

40 :1=35=38:02/02/11 05:18
>39
Thank you for your useful information.
I will consider and try it next time when I need to amplify
GC rich insert!

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 05:45
direct-PCRも満足にできないポス毒なんて聞いたことがねえな。

42 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 07:35
爪楊枝は使い捨てたほうがいいかも。
site directed mutagenesisとかしてるときだと、使いまわした爪楊枝
のせいでfalse拾うこともあったようにおもうので。
ちなみに、皆さんのご指摘のようにpfuでない限りどのtaqでもうまくいくと思います。
菌体を入れすぎないのはポイントですね。寒天も入んないように。
寒天入ると反応終了後の液が黄色くなってて欝です。
ちなみに、私は反応vol. 20ul, taq 0.2ulでやってます。
私は33さんとおんなじようにやってます。マスタープレートで
つついた菌を拭う感じで。
自分の経験では2kbぐらいまでならうまく逝った記憶がありますが、
できれば1kb以下に抑えた方がよいように思われます。
菌体とか寒天とか、ゴミが入りやすいぶんPCR増えにくいのではないかと。

役に立ちそうな情報を提供できなかったのでsageます。

43 :18:02/02/11 07:43
ore ha 3.2kb demo ba-cchiri fueru YO!

44 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 07:59
爪楊枝はいつも使い捨てじゃ無いの?
使いまわす必要性なんて全然ないじゃん。
そういえば爪楊枝の元の木の種類によっては
うまくいかなくなるなんて事をどっかのスレで
見たような気がする。


45 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/11 09:48
Why do you not use sterile tip for the 200P ?

46 :1です:02/02/11 16:25
M13で試してみたらうまくいきました。
今まではT3T7で問題なかったのですが、こんなことも
あるんだと感心しました。
特に13さん、ありがとうございました!

47 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/12 03:22
>>45
Because we don't have enough money, damn it!

48 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/12 19:18
ようじの方が先が鋭いのでコロニーおおすぎの時にはよい。

49 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 00:25
>>32
同感。手間もアルカリSDS処理以外いっしょの操作だし。
古い人間なのかなあ。

50 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 02:02
insertが一つで、しかも両端の制限酵素サイトがstickyなら、
dirct-PCRはしないで、mini-prep -> sequencing。この場合、
colonyは3、4つ拾えば十分。

16個くらいcolonyを拾わないと当りクローンがなかなかとれないとき
(insertが二つ(triple ligation)や、両端がblunt-endなど、
ligationの効率が良くない場合)には、direct-PCRで当りcloneに
目星をつけて、やはりその後はmini-prep -> sequencing。

51 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 02:21
>>

insert長いならEX-Taq使えばあがるよ。
rTaqは腕の悪い漏れには2kbが体力の限界。
ちなみにコロニーPCRであがんないことなんて
無い。悪いのは>>1の腕ではなくてTaqじゃ。
ということにしとけ。


52 :>51:02/02/13 02:33
ありがとうございます。でも、M13なら動いたんです。
インサートとプライマーの相性である、と結論付けたのですが・・

53 :18:02/02/13 02:52
The AmpliTaq is the best DNA polymerase for the direct-PCR using any kinds of primer including T7, T3, SP6, M13, etc.

54 :13:02/02/13 08:15
通常、俺は10uLの系でやってるよ
つまようじは液を吸うのでまず使わないな
コロニーを突くのはクリスタルチップが一番いい
泳動での確認には1ー2 uLの反応産物を使用し、
当たりのクローンは残りの反応液を使ってダイレクトシークエンスへ
腕があがると確認が目的なら5uLの系でもできます
シークエンスを確認してからプラスミドを取りますね、通常わ





55 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 08:21
>13
3 kbもの全長をPCR産物だけでseqするのは無理です。
よって、direct-PCR -> 当りクローン -> mini-prep -> sequencing
が最も効率的なやり方。

56 :13:02/02/13 12:16
ま、せいせい1.2kbのシンサートまでだな

57 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 12:18
すまそ、インサートだった

58 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 13:23
またまたすまそ、せいぜいだった

59 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/13 23:54
>>58
さては日本人じゃないな?

60 :49:02/02/17 03:02
>>50
うーん、昔なら48本くらいなら平気でminiprepしてたなあ(遠心機16x3回)。
今は96wellで培養→miniprepするからやっぱりPCRはかけない。
最終的にプラスミドが欲しいんだったら。

61 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 19:53
あげ


62 :生きる価値無し:02/03/22 22:56
>>1
俺はM13とreverseでPCRしてる。
250bp付近の小さなバンドしかでないなら、それはno insertでは?
mini prep、次いでdigestionすれば確認はできるでしょ。
colony PCRはinsertとなる遺伝子によってはPCRが走り難い事もあるらしい。
insertが長すぎても無理なはず。
でも、これらが原因ならbandは出ないので、小さなbandがあれば当てはまらない

63 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 01:14
あんたらレベル低すぎ。

64 :お約束:02/06/27 21:02
>>63
オマエモナー

65 :名無しゲノムのクローンさん:02/06/27 22:17
TakaraのZTaqでCDPCR試した人はいます?
漏れは普通のTaqなら上手くいくんだけど、ZTaqの時は
なんか、上手くいかない事があるんです。
何がわるいんだろ?

66 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/08 13:45
ていうか、PCRをやたら重視するのって、アホ私立出身の医者がphDとるのに
するクソ論文のための実験だろ?
適当に検体選んで、30例にRT−PCRしたらこんな結果が出ました、みたいな。
センスがあればPCRなんて簡単なんだよ。世の中の人はもっと高度なことで悩んでいるわけ。


67 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/09 09:30
>66
センスもクソも、ただのテクニックと思われ

68 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/14 00:47
普通簡単に出来るけどなぁ。

69 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/20 23:00
単発質問でスレ立てんな。
夏厨並みの脳味噌しかないくせにPCR?
笑わせんなって。


70 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/23 01:50
>>69
「くせに」、ってPCRなんて夏厨並の脳味噌でできるだろ。
私大医学部ですか?
PCRうまくいかなかったらさっさとプライマーデザインしてオーダーした方
が早いですが、なにか?
1ペアのプライマーにこだわる金がないラボは金のあるラボに
スピードで負けますが、なにか?

71 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/28 01:53
んだね。

72 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/28 03:50
細胞壁があっても可でしゅか?

73 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/28 12:16
>>70は私大医学部に流されたドナ子牛か?w

74 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/28 14:01
>>73
お前だまとれ。
おうちでオナニーしてろ。

75 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/28 14:03
おまいが黙れ

76 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/28 22:38
>>74
図星だったか。

77 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/29 01:25
>>72
大腸菌でやるんだから細胞壁は当然考慮のうちですよ。

78 :響子:02/09/29 16:12
一度に何colonyくらいやってますか?

79 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/29 16:31
>>77
バカ発見

80 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/29 20:22
>>77
相当なおばかだな。オースティンか!?

81 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/02 10:15
ばかさらしあげ

82 :2チャンネルで超有名:02/10/02 10:41
http://www.tigers-fan.com/~xxccxxc

http://www.tigers-fan.com/~kaaax

ヌキヌキ部屋に直行
  コギャルとヌキヌキ
  全国地域別出会い

83 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/05 22:53
馬鹿はヌキヌキ部屋にでも行け

84 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/19 13:14
77 :名無しゲノムのクローンさん :02/09/29 01:25
>>72
大腸菌でやるんだから細胞壁は当然考慮のうちですよ。


85 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/19 15:00
アフォ?

86 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/19 15:04
http://www.hamq.jp/i.cfm?i=dehio
このサイト面白いよ

87 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/09 13:34
クイック→プレップ→制限酵素
で、インサートのチェックやってます。
プライマー高いので(貧乏)

88 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/13 22:21
ちょっとまたんかい
プライマーなんてただ同然やん
両方で4000円
これで何回分?
だいたい5〜10pmol/回やから2000〜5000回分
インサートチェックだけで使い切ったヤシおるんか?
まあPCR酵素は制限酵素よりは高い罠
それでも東洋紡のKOD’つこたら1/4にけちれる


89 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/15 17:21
しかしまあ、insert check はPCRと制限酵素処理のどちらがいいのだろうか?
PCR check のほうが速いように思うが。当方の場合、phage溶液を希釈した系での
direct PCRも行っている。colony PCRは全く問題なし。現在は酵素の質がよくなって
きているので、溶液内の不純物も数年前ほどには問題にならない、というのが現在の
通説なのでは?

90 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/30 02:35
コロニーをつついた後の培養はどうしてる?
プレートにストリークだと、当たりのを培養するのが遅れる。
14mlチューブでいきなり振ると、振る場所が足りない&はずれのチューブが
もったいない。
1.5mlチューブを使って37℃静置かローテートで菌がどんどん増える培地と
いうのをどこかで見た気がするのだが、誰か知らんか?

91 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/30 03:04
>72
当方、大腸菌はもちろん、酵母、アグロバクテリウム、コリネバクテリウムでもコロピーしてます。
EXtaqを使えば4Kまで増やしています。

92 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/30 05:36
>>90
朝PCRを仕掛ける時にプレートにストリーク、夜帰る前にチューブで培養開始。
どの道一晩振るのでこれでOKとしてます。

>>91
酵母は結構コツがいるような気がする。大腸菌とおんなじようにやったら
結果にばらつきが出た。10ulぐらいの水に一回希釈してから0.5ul(/20ul系)
使うと大体再現が取れた。まあ目的にもよるけどね。
大腸菌、アグロは深く考えなくてもOKだった。
Extaqって、コロピーに使うには高くないでつか?

93 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/30 06:25
>92 長いやつをとるときだけだろ?<ExTaq
うちはそれしかないから全部だけど。でも失敗だったかも。。
タンデムリピートだからどんどん短くなっていく。。

94 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 17:57
>>90
BIO101から出てたな


95 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 17:59
>90
普通の培地に硝酸カリを1%入れるってのがこの板のどこかに出たた
そのレス書いた人
ここ見てたら情報きぼーん


96 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 18:10
>95
本人じゃないが自分もどこかで見た。
場所はすぐには出てこないが確かに10g/1Lと書いてあった気がする。
グルコースみたくオートクレーブのあとに加えるんだろうか?

硝酸カリウムというと黒色火薬に酸化剤として使うやつだろうが、
硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウムなどでも行けるんだろうか。
pHを考えると、強酸と強塩基の塩がよい?


97 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 20:14
>>94
今はQ-BIOgeneですよね?
http://www.qbiogene.com/
探してみます。

98 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/21 11:49
GS96 Broth
http://www.qbiogene.com/products/media/bacteria/gs96.shtml
これか。重量あたりの値段は LB の約 4倍。
これとか CircleGrow とか使ってるひといます?


99 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/21 20:50
あー、またやりやがったよ。
なんでバンドでないんだ?
「ちゃんとやってるのか?」
「やってます」
こりゃダメだ。。。。

100 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/21 21:03

 \ ハイハイ 今だ100ゲットズザー っとくらぁ/
    ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄V ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄

            ∧∧
           (゚Д゚O =3
      ⊆⊂´ ̄  ソ ヤレヤレ

ドッコイショ・・・・・・・・・
 ̄ ̄ ̄ ̄ ̄∨ ̄ ̄ ̄
     ∧∧          (´;;
    (゚Д゚ ,)⌒ヽ    (´⌒(´
     U‐U^(,,⊃'〜... (´⌒(´⌒;;

ハァ、ダルッ・・・帰るか
 ̄ ̄ ̄ ̄ ̄∨ ̄ ̄ ̄
  ポ  ∧∧  ポ
  ン  (゚Д゚ ,) . ン
   (´;) U,U )〜 (;;).
(´)〜(⌒;;UU (´ )...〜⌒(`)

101 :43:02/12/22 03:45
コロニーPCR8サンプル(8連チューブ1本)。
2mlエッペンに培地を入れて16×5のエッペン立てで振とう培養。
あたりのチューブだけそのまま遠心。ミニぷれっぷ
という感じでやってます。
最初はエッペンで増えるのか不安だったけど問題なし。
やや、増殖が遅い気がするけど。


102 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/24 06:57
プレートのままコロニーを大きくして、かきとってminiprepしていた人もいたが……


103 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/24 19:54
サテライトコロニーが出やすくなるという諸刃の剣
まあ素人さんはガラスの試験管に綿栓で振ってなさいってこった


104 :山崎渉:03/01/11 13:40
(^^)

105 :山崎渉:03/01/18 13:17
(^^)

106 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/17 03:56
空揚げ     

107 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/17 23:44
>>90
コロニー突く

プレートにそっと触る

PCR mixに楊枝を入れて底を一突き

液体培地に入れてこする

108 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/17 23:50
コロニーPCRが何でこんなに流行ってるんだ??
みんな大腸菌さまが好きなんだねぇ〜・・・藁

109 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/18 00:23
ひとつ聞きたいです
シークエンスプライマー流用でいけますか?
18merとかでPCRするの、きしょいんだけど

110 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/18 00:28
何が気書院だ?おまえがきしょい

111 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/03 23:51
先輩が、コロニーPCRでは、例えべクターの取り込みが成功してても
バンドなんて増えないよ、といってるのですがマジすか?

112 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/04 01:54
質問なら上げて聞いてみれば?

113 :山崎渉:03/03/13 13:48
(^^)

114 :山崎渉:03/03/13 13:56
(^^)

115 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/21 00:19
>>109
ぜんぜん問題無い。というかユニバーサルとgene-specific primer
を掛け合わせてインサートの方向決めなんてよくやるじゃない。

>>111
線状DNAと違ってプラスミドは熱かけたときのホグレが悪いというのは
あるけどねえ? ちなみに俺は全量10ul,40サイクル,
ほぐしは30-60秒かけてることが多い。(短いのは別に
いろいろかんがえんでも増えるけど。。。)

ところでインサートの移し変えでゲル精製もやったのに,切れ残りが
コンタミしていてコロPはもちろんOK。で,シーケンスしたら元の
ベクターがとれてましたということがあった。
こういう時はコロP万能じゃないねえ。やはりミニプレやるべき実験だったと
赤面しますた。

116 :109:03/03/21 13:06
>115
レスありがと。問題ないのですね。
でも、30merにしたのを作ってしまいましたです。

>こういう時はコロP万能じゃないねえ。やはりミニプレやるべき実験だったと
赤面しますた。
コロPはScreening目的程度と考えた方がいいかと。
プレートにDNAぶちまいて、そこからPCRするわけだから
大腸菌由来でないDNAも原理的には増幅されるかと。
たまたま2クローン重なってて、一方だけPCRで増えることもあるかと。
(シングルセルアイソレーションするならいいが、しないでしょ)

117 :109:03/03/21 13:10
>116
シングルセルアイソレーションはシングルコロニーアイソレーションね

118 :山崎渉:03/04/17 09:29
(^^)

119 :山崎渉:03/04/20 04:16
   ∧_∧
  (  ^^ )< ぬるぽ(^^)

120 :山崎渉:03/05/22 00:19
━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅(^^)]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

121 :大山崎渉:03/05/25 08:33
━―━―━―━―━―━―━―━―━[阪急大山崎駅ヽ(`′)ノ]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

122 :山崎渉:03/05/28 14:19
     ∧_∧
ピュ.ー (  ^^ ) <これからも僕を応援して下さいね(^^)。
  =〔~∪ ̄ ̄〕
  = ◎――◎                      山崎渉

123 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/07 22:24
コロピーばんざい

124 :_:03/07/07 22:25
http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

125 :山崎 渉:03/07/12 12:22

 __∧_∧_
 |(  ^^ )| <寝るぽ(^^)
 |\⌒⌒⌒\
 \ |⌒⌒⌒~|         山崎渉
   ~ ̄ ̄ ̄ ̄

126 :なまえをいれてください:03/07/24 18:04
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ?(俺を買え)」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。)
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

127 :山崎 渉:03/08/15 19:47
    (⌒V⌒)
   │ ^ ^ │<これからも僕を応援して下さいね(^^)。
  ⊂|    |つ
   (_)(_)                      山崎パン

128 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/16 05:24
テンプレートに動物細胞ゲノムを使用したいのでつが、
コロピーみたいにするの可能でつか?

129 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/16 07:18
できまふ
コツは
欲張らんこと


130 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/16 12:21
コツまで教えていただいて
ありがとうありがとうございまつ

131 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/19 00:51
なんか山崎パンってペニスマンみたいだなー


132 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/31 21:01
血をダイレクトPCRするキットの試薬の中には何が入っているのですか?
できれば自前でやりたいのですが。

133 :遅レスマン:03/12/05 20:10
血液はあかん
ヘムはTaqの阻害剤や


134 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/06 23:31
エチジウムブロミドで染色したときに、染色度合いに差があるのってどうしてですか?
どなたか教えて。

135 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/02 23:32
DNAが多いか少ないかだろ
そんなことなぜ聞く?


136 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/19 14:51
ふと思ったのですが、
コロピーした後そのままシークエンス反応に持っていってもいいんですか?
いままでコロピーで当たったものをミニプレしてからシークエンス反応に
持っていってたのですが…
そういえば何のためにミニプレってするんだろう?目的遺伝子を増やすため?

137 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/23 03:36
してから考えてもいいんでないかい?
うまく読めなかったら羹に懲りて鱠を吹くってことで

>ミニプレ
プラスミドがほしいから

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