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ダイレクトシークエンスについてどうか助言を!!

1 :Sage:02/03/09 01:37
PCR産物を使用したダイレクトシークエンスがうまくいかなくて困っています。
卒業まで時間がないためサブクローニングしてられません・・・
使用しているkitはApplied Biosystemsの
BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Reaction Kitです。
ゲル抽出して精製したDNAでもほとんど読めません。
そこまで正確に読めなくてもどのような遺伝子か同定できればいいのですが。
いいプロトコールを知っている方、どうか教えて下さい!!

2 :憲正:02/03/09 06:15
イヤだね。

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/09 10:16
卒業延長age

4 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/09 11:32
はっきりいってダイレクトシーケンスあてにしてやるようじゃ実験者としてだめだね。
ちゃんと失敗したときの事を考えて予定組まないと。
とりあえずは切りつめたもう遺伝子取ってるならligationからだからういまくいけばシーケンスまで2日あればなんとかなるでしょ。
サブクローニングをしなさい。

5 :1:02/03/09 15:06
っていうか、うまくいっている研究室もあるんでしょ。
だったら少しでも時間を無駄にしないために試みるのは実験者として当然じゃないの?
>3
データはいっぱいあるから失敗しても卒業延長になんかならないよ。
自分の興味で卒業までに明らかにしたい遺伝子があるだけ。

6 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/09 15:31
TAクローニングキットを買ってもらって、一日でサブクローニングすれば
良いんではないでしょうか?

7 :sage:02/03/09 15:49
>>5
ダイレクトシーケンスが失敗した時のために、
並行してサブクローニングもしておく。
時間がないなら、そういう実験計画をたてるべきだ
ってことでしょ。

8 :親切な人:02/03/09 15:50

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9 : :02/03/09 18:50
>>1
シグナルが弱いのか、overlapするのかぐらいは書けや

10 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/09 22:02
はっきりいってダイレクトシーケンスあてにしてやるようじゃ実験者としてだめだね。


11 :名無しゲノムのクローン:02/03/09 22:29
>1
がんばれ〜!
今までした人の腕が悪いとか!?
っていうか、2ちゃんねら〜に相談するなよ!(笑)

12 :あぶ:02/05/16 00:20
>1
ゲル抽出でも読めないのはおかしい。
template DNA量などの基本的な条件が間違っているのでは?
PCR programが違うとか。
泳動した時にsingle bandになればカラムで精製するだけで読めるはず。
あと考えられるのは、偶然同じ大きさのPCR産物があって、
シークエンスが読めないとかだね。


13 :名無しゲノムのクローンさん:02/05/16 04:47
>>1
同定できりゃいいって、PCRでとったんですよね?
degenerateで取ってきたやつが当たりかどうか確認したいってことか?
何度もうまくいかないダイレクトシークエンスに時間と金を費やすより
がいしゅつだけどサブクローニングなんて数日で終わるんだからさくっと
クローニングすることをお薦めする。
つーか、degenerate PCR だったんならなおさら。degenerate primerで
シークエンスしてるのか?それってうまく逝くのか?
そんなスレが昔あったっけか・・・・。

いまいち何がしたいのかよくわからん。1よ、もうちょい状況説明キボンヌ。

14 :名無しゲノムのクローンさん:02/05/16 10:44
おまえら、遅すぎる。
もう1はどっかいってるんだからほっとけ

15 :名無しゲノムのクローンさん:02/08/03 05:18
うぷっっp。

16 :書けませんよ。。。:02/09/16 10:26
真・スレッドストッパー。。。( ̄ー ̄)ニヤリッ

17 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/29 20:37
はっ!

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/29 21:08
とりあえずPCR厨房スレッドへ移転ということでどうでやんすか?
>1
同じ質問をそこでなすっては?


19 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/25 20:13
うちはPCR産物、マイクロコンで精製してそのままダイレクトシークエンスやってるけど、
プライマーによってきれいなのもあるし、きれいでないのもある。サイクルシークエンス
の条件変えてみたら?

20 :お前ら:02/11/25 20:17
>>18,19
1がスレたてた日付よくみれ!

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/26 05:25
というわけで

--------------------------終了------------------------------

22 :山崎渉:03/01/11 13:49
(^^)

23 :山崎渉:03/01/18 13:25
(^^)

24 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/29 21:15
あげとけよ。

25 :山崎渉:03/03/13 14:16
(^^)

26 :山崎渉:03/03/13 14:25
(^^)

27 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/10 23:03
俺は基本的にはダイレクトシーケンスできてるぞ。
primerとtemplateの比率が最重要だと思う。3倍違えば結果も大分違うぞ。

28 :山崎渉:03/04/17 09:02
(^^)

29 :山崎渉:03/05/22 00:29
━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅(^^)]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

30 :山崎渉:03/05/28 14:27
     ∧_∧
ピュ.ー (  ^^ ) <これからも僕を応援して下さいね(^^)。
  =〔~∪ ̄ ̄〕
  = ◎――◎                      山崎渉

31 :なまえをいれてください:03/07/24 18:14
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ?(俺を買え)」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。)
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

32 ::03/08/12 07:59


33 :33:03/08/18 22:48
33げっと

34 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/29 15:03
http://up.isp.2ch.net/upload/c=03okari/index.cgi

35 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/29 15:05
http://up.isp.2ch.net/up/492f1b9763c1.wma

36 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/11 14:49
age

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