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大腸菌の発現についておしえて。

1 :帝大医学部生:02/03/14 23:29
あるヒトの酵素を大腸菌で作りたくて、
発現系を構築したけど上手く行かないんだ。
もちろんベクターはあってるし、大腸菌にも導入確認済み。
なのにいろいろ試したけど、全然ダメ。
いれた遺伝子長分のタンパクもできやしない。
RTSもだめ。
どうしたらいいか教えて。
ちなみにN末にタグあり、タグ下に全長つなげてます。

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 23:53
帝大医学部性って山田みたいな?

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 23:57
帝京大ですか?

4 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 01:52
in vitroでの発現系を使うべし

5 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 01:53
うーん、ネタなんだかマジなんだか判別苦しむな。
とりあえず発現も満足に行かない奴は医歯薬板で遊んでもらえ。

それがイヤなら、「タンパク質の精製」スレを探して読め。

6 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 01:55
>>4
RTSが見えないのか?

7 :おくづみ公一:02/03/15 01:57
帝京大のラクビー部ですか?

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 02:07
マジなら「上手く行かない」をもう少し具体的に書いて下さい。
ベクター、大腸菌に関する情報も書いた方がいいでしょう。
酵素の種類や、アミノ酸数も書いた方がいいでしょう。

とにかく、これだけでは漠然としすぎていて答えられません。

9 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 02:11
まじでねたでしょう。

10 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 02:16
専門家がいるタンパク質の精製スレで聞けば事足りると思うが。
わざわざスレ立てんでも、、。

ただ、生物板では稚拙な質問は嫌われるから(まぁ当たり前だが)
>>8が言うように、もう少し答えやすい質問を考えるべきでしょうね。

11 :あほさん:02/03/15 04:48
使用してるvectorと大腸菌の名前を書きなさい。
作られる蛋白が可溶化せずにwesternでdetectできないとか、あとは、
その蛋白が大腸菌にとって毒性を示してるとかもあるし一概にはレスできない。
insertの途中でstopが入るとかの凡ミスはないの?
sequenceをちゃんと確認してみなよ。
抗体が使えるかの確認もとってるのか分からないしよ。
蛋白の立体構造によって抗体が機能しない事も考えられる。


12 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 07:49
上手くいかない理由をちゃんと書けない人ようなだから上手くいかないんだよ

13 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 09:23
うまくいかない理由がわかってたら自分で何とかしていると
思うんだけど・・・。


14 :泥沼歩兵部隊:02/03/15 11:56
ということで詳細がわからないので詳しいコメントはできないけれども、
「ベクターがちゃんとしていて、にもかかわらず発現が全くみられないとき」
私だったらどういうことを想定するかを書いておきます。

(1)ベクターとホストの組合せが間違っている(たとえばDE3が入ってないのに
pETつかってるとか)
(2)ベクターの薬剤耐性と培地の組合せが間違っている。(本当Ampだけ
でいいの?とか)
(3)発現はかかっているが、毒性が強いので、発現のいい菌からさきに
drop outしていく。結果発現しない菌/plasmidを落した菌が生き残る。
(4)毒性は強くないのだが、極端なオーバーエクスプレッションが菌に
ストレスとなって結果的にplasmid drop outを招く

対策 (1)(2)に関しては自分でちゃんと調べること
(3)(4)については低温で培養する、発現誘導を弱くする、培地を変える、
pLysSホストを用いる、lacIq搭載plasmidに載せ変えるなどの
方法があります。

15 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/16 03:24
>14 おお、それそれ。立派なレスだ。
>1はきっとそういうことが聞きたかったに違いない。
他の人、付け加えることない?

16 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 01:07
プレートのコロニー。できるだけ多くを拾って2ml程度の培地で培養して凍結保存しておく。
プレート上で置いておくと、発現している株まで発現しなくなりました。
特に分子量の大きいタンパクを発現させているものほど。
同様の経験したヒト、ほかにはいませんか?

17 :帝大医学部生:02/03/17 02:11
お前ら口だけだな、
お前らに聞いた俺が馬鹿だったよ。

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 04:53
>>17
>俺が馬鹿だったよ。

ようやく気が付いたのね

19 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 04:55
>>18
そのくらいにしとけ
それ以上帝京を馬鹿にすると俺も引けなくなるからな。

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 09:02
某帝大医学系研究科ラボですが、フリークオーターで居着いたDQN医学部生が>>1の状況でハマっています。
他人にものを教わって礼もいえないDQNですが、どうすればよいでしょうか?

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 09:24
>>16
私の場合、恒常的活性型のプロテインキナーゼを持たせた
大腸菌は、プレート上で安定に保持されないことがありました。
グリセロールストックから直に液培に移すと大丈夫だったのに。



22 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 11:08
>>20
つーか東大やね。ほっときゃいなくなるでしょ。

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 19:21
もう少し真面目に考えてくれよ。
ベクターとホストは既製品(インビトロゲン)で、間違えようないし。
RTSでもだめだから、毒性とは思えないし。
シーケンスもあってるよ。
薬剤もAmpとCrmでいいし。
温度、誘導条件もけっこうやった。
そのうえで聞いてるんです。お願いしますよ〜。

24 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 19:44
>23
それだけやってダメならあきらめろ。
発現しないこともあるぞ。



25 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 19:46
>20
君の身元がわかっちゃった。

26 :泥沼歩兵部隊:02/03/17 20:20
>23
(1)RTS(ってロシュのセルフリー系ですか?)でもだめ、ということ
ですが、リボソームに直接毒になるようなケース(RNaseとか)はRTSでも
だめだと思います。そういうときはだまされたと思って小麦胚芽の系
を試すといいかもしれませんね。

(2)実は蛋白質はできているが、非常に微量であって検出に失敗している。
たとえばものすごく沈殿がしやすく、強固なアグリゲーションを形成する
ため、そのあとのSDSサンプルバッファーを入れても、可溶化しない、電
気泳動にかからない。
(3)7回膜貫通型レセプターやその他の膜埋め込み型蛋白質にありがちな、
電気泳動試料調整がトリッキーなケース。たとえば1% SDSではだめ、とか
ボイルするとゲルに入らなくなる、とか2-MEの濃度の問題など。
(4)発現させようとしている遺伝子のmRNAの二次構造が非常に特殊で、
発現がえらく悪い。
(5)4のバリエーションで、たまたま偶然発現させようとしているmRNAが
自己切断活性をもってしまったため、mRNAが分解してしまっている。

(4)(5)はまずありえないと思うのですが念のため。

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 20:35
codon usageを確認してみるとか。
あと、エアレーションが良くないと、極端に発現が悪かったこともあった。

発現させたタンパクを何に使うのかにもよるけれど、これだけやって
ダメだったら、大腸菌にこだわらない方がいいと思うけどなあ。

28 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/18 01:38
1.ベクターを変える
2.大腸菌以外にする

29 :16:02/03/18 08:40
>>21
私の場合は、転写因子と膜タンパクの一種でプレート上に保持すると2-3日で培養しても発現しなくなりました。
同様に、グリセロールストックしたものは大丈夫でした。
以後は30サンプルぐらい、まずストックしてから発現量の多い株を探すようにしています。

30 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/18 23:50
もういい!
バカばっかりだ。
そんなことぜんぶやってるんだよ。
この酵素がないと研究費とれないんだよ。
ボスから言われた事しかしてないソルジャーはこれこれだから困る。

31 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 00:35
>>30
すまん。
>>3の書きこみと発言内容の程度から、
今までてっきり帝‘京’大学医学部生だと思ってた。

いやマジで。

32 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:12
>>30
> バカばっかりだ。

人に色々教えてもらっておいてバカ呼ばわりする君が一番バカだよ。

> ボスから言われた事しかしてないソルジャーはこれこれだから困る。

発現もできないお前はソルジャー以下だね。

33 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:20
>>32はいい事をいった。

34 :泥沼歩兵部隊:02/03/19 01:30
>30
お見それしました。本当に「そんなこと」は全部やっているんですね?
だとしたら、きっと「これはやっていない」ということを確認することを
お薦めします。

適当なキットを使って、IPTG添加後の大腸菌のNothernをやって、
ちゃんとmRNAが全長できているかを是非確認してみてください。
いろいろ理由があるのでRT-PCRはうまく行かないと思います。
最新のキットを使えば可能かもしれませんけど自信ないです。

ここでmRNAの量が少ないようなら、絶望的です。また全長ができ
ていないようなら、ひょっとしたらBL21-STARという新製品の
ホストが役に立つかもしれません。他にもRNAseを欠損させた
大腸菌株が知られています(ほとんどは非売品ですが、いくつかの
ラボにコンタクトすれば分けてもらえます)ので、うまく行かない原因を
mRNAが短寿命であることに絞って改良すればいいのではないでしょうか?

35 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:32
>>32の言う通りだ。
1は死んでしまえ。
お前にやる研究費なんかない。失業して首を吊れ。
無礼、失礼なヤツは大腸菌以下だ。
おっと、これは蛋白さまを発現してくれる大腸菌に対して失礼だった。

36 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:36
ごめんなちゃい。

でも、もし下の学生か、部下が同様の問題で悩んでたら
なんて指導する??
上記の答えじゃあ信頼なくすよ。



37 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:39
>>35
だってくれるんだもん。
君たちには一生当たらないけども。

38 :貧乏ラボ:02/03/19 01:43
>>1
大腸菌はあきらめて、動物細胞発現系でやってみたら?
発現させたい遺伝子の配列をコピペしてよ、無理だと思うけど

39 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:49
>上記の答えじゃあ信頼なくすよ。
そんなにひどい返事ばかりではなかったと思うけど?
特に泥沼歩兵部隊さんのレスは的確で、同じようなことではまっている俺にも参考になったよ。
あと、
>そんなことぜんぶやってるんだよ。
って言い切るくらいなら始めっからそれ全部書きなさいよ。
あんた自身が説明不足だからお望みの答えが返ってこないだけでしょ。
そういうのを逆ぎれって言うんじゃない?
つーか全部ネタじゃないよね?

40 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 02:00
ちょっと言い過ぎたと思うので謝ります。

>>36 基本的に部下の指導はしない。
とこれでは解答になっていないので、確実なポジコン、ネガコンを用意して
@まずウエスタンの系を疑う。
Aウエスタンの系は動いており、かつ数種類のホストで発現していなければcodon usageを確認する。
B問題なければ大腸菌株をトコトン替え、発現株を探す(同時にインダクション等の条件も探る)。
Cそれでもダメならタグ等を取って発現蛋白のサイズをできるだけ小さくする。
Dそれでもダメなら大腸菌をあきらめる。
Eそれでもダメならvivoの発現系を試す。
Fそれでもダメなら発現させるのをあきらめる。
ケースバイケースだが、通常、俺がしている程度のプロジェクトでは
>>34さんの方法まで取って問題解決して発現にチャレンジは多分しない。
違う実験を考える。
例え信頼をなくしても部下には「わからん」と答える。

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 02:05
こんなヤツほって置けよ。
トラブルの説明もできない。
傲慢、礼儀知らず。
人付き合いの仕方をしらないバカ帝大医学部生か何もかもがバカなDQN生物屋かだ。

42 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 02:13
タンパク発現も出来ん阿呆が研救なんかするなー
ほんとーにイ学部生ならとっとと医者にでもなって看護婦でもこましてろー
えらそうに研究者ぶるなー
そのほうが気味にとってもシアワセだろう、忠告してやるよ。

43 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 02:58
>>36
ココは医歯薬板じゃないんだよ。
質問に対する回答一つとっても情報としての価値が全然違うのだから、
もう少し実社会に近い礼儀をわきまえた方が良いと思うぞ。

本当に努力してもなかなかうまく行かなくて困っている奴には、
泥沼歩兵部隊氏のような各分野の熟練者が
有益なサジェスチョンをくれることが往々にしてあるのが生物板。

それなりの礼儀の奴には、それなりの対応になるのは当たり前だわな。

44 ::名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 03:16
>>43
は、非常に良い事を言った。ていうか質問者の最低の礼儀なんだけどな。

45 :発現しないっす:02/03/19 10:03
便乗
ここに配列書き込んだら意見もらえますか?それともその前にこれ使って配列に
妖しいところないか調べとけっていうのありますか?

46 :泥沼歩兵部隊:02/03/19 10:34
それにしても「全く発現していない」のか「微量には発現しているけれども
検出に失敗している」のか「微量に発現していて、沈澱に行っていて
使い物にならない」のかは大違いだと思います。
あと「全長は発現していないが短いフラグメントは検出されている」という
のも状況は別です。
これらの状況の判断は、結局のところ実際に実験している人しか判断でき
ないと思います、ので
1氏は自分ではどのケースだと思っているのか、またその実験的根拠は何か
もう少し具体的に情報をオープンしたらいかがでしょうか?


47 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/29 01:53
>泥沼歩兵部隊先生
あなたは最高です

48 :名無しゲノムのクローンさん:02/06/28 07:08
>>29 そういうときって、プラスミドが落ちるから発現しなくなるんですか?
それとも、プラスミドちゃんとしてそうなのに発現しなくなるんですか?
今、後者ではまっています。形質転換してから出てきたコロニーを直接培養
したものだとNi-NTAでモノっぽいバンドが見えてきたんですが、プレートから
再度とってやっても再現性がありません。
ちなみに、BLR(DE3)pLysS+pET-28+1mM IPTG モノは結構疎水性だとおもいます。
沈殿部を2%SDSやぎ酸で処理した画分にもモノは来ていませんでした。

>>26 泥沼先生 よろしかったら3の具体例を教えてください。特に1%SDSではだめ
というのが気になります。

49 ::02/07/04 17:47
>48
同じ経験あり。薬剤耐性は保持されるので、プラスミドの脱落よりも、
遺伝子変異のためと思われる。
原因は非誘導時のモレで(pLysS等の利用により非誘導時の発現は抑制
されます、なんて本当ではない)、pET系では頻繁に起こるみたいだ。

培地に1%程度のグルコースを添加しておくと、プレート上でコロニー
の安定性は飛躍的に上がる(カタボライト・リプレッションのため)。
長期保存(グリセロールストック)でもグルコース添加する方がいい
かもしれない。よく知られていることみたいだけど。

沈殿の可溶化を urea でやってみた?


50 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/04 18:02
>同じ経験あり。薬剤耐性は保持されるので、プラスミドの脱落よりも、
>遺伝子変異のためと思われる。
でも、そこから取ったプラスミドをもう一回形質転換してから
発現誘導するとちゃんと発現するよ。


51 : :02/07/04 18:16
>1あきらめな。

以上、終了。

52 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/04 18:31
>48
>26
(3)7回膜貫通型レセプターやその他の膜埋め込み型蛋白質にありがちな、電気泳動試料調整がトリッキーなケース。

このケースに当てはまると思うが、glucose transporterなんぞは、sample調製して、熱処理したらだめ。全部アグル。SDS sample bufferに溶かして放置、そしたらうまくいく。


53 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/04 19:48
\ http://www.geocities.co.jp/Hollywood-Screen/9038/
   ̄ ̄V ̄ ̄ ̄ ̄ ̄ ̄
 ∧_∧   
(℃ ゜ ) ̄ ̄つ
 U ̄U ̄UU


54 :X:02/07/05 05:48
>50
>でも、そこから取ったプラスミドをもう一回形質転換してから
>発現誘導するとちゃんと発現するよ。

言葉タラズ、スマヌ。
「宿主ゲノムへの」遺伝子変異が起こっている、という意味。
大腸菌の嫌がる蛋白質がターゲットなら、起こりやすい現象と
思う。

55 :48:02/07/07 01:56
みなさん、いろいろありがとうございます。
とりあえず、全部の培地に20mMグルコースを入れてみます。
暇つぶしに、グルコース入り培地+PMSF存在下発現で
発現が復活するかどうか見てるところです。

変異のためだったんですかね..すごい部位特異的変異原性だなぁ・・
でも、発現前は元気に育っていたのでそんなに君のプレッシャーになってたとは
お兄さんは知らなかったよ・・ ごめんね>菌

>49 可溶化はいろいろやってみました。やったもの→8M urea, 6M GuaHCl
8M urea+2% SDS+boil, 6M GuaHCl+2% Triton-X100, 6M GuaHCl+SDS (ω

>52 SDS sample bufferに溶かして放置・・φ(..)
SDSでだめなときって、どんな時なんでしょうね?

56 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/10 10:15
T7 polymeraseはterminator領域のどこまで転写するんですか?
何が聞きたいかというとpET-28cとかだと、終止コドンがterminator領域に
かぶるんですけど、そういう時、翻訳産物はどうなるのかな?と。


57 :a:02/09/29 00:45
teiki age

58 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/29 05:19
pET利用者スレとして再出発

59 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/01 00:48
支持age

60 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/01 22:38
pETの日本語マニュアル欲しい〜〜あげ(業者がもってきてくれない)

61 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/09 21:11
>>60
持ってねーの?ダサッ!

62 :通りすがり:02/10/09 23:43
私は使ったことがないのですが、セルフリーの系でちょいと変わった
PURESYSTEMというのがあり、RTSで失敗しても上手くいく場合があるそう
です。原理などはタンパク質の精製の板に詳しく
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/982464137/l50

63 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/10 00:08
↑宣伝ヤメレ。いずれにせよ大腸菌のmachineryを使ってるんだから、不溶画分に来るやつはいかんともしがたいだろ。

64 :名無しゲノムのクローンさん :02/10/10 00:37
↑で、先生のご存知の系では、さぞなんでも発現できるんでしょうね。
すばらしい。

65 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/10 00:40
↑ヤレヤレ、宣伝を咎められたもんだから、これでツッ込んだつもりか…

66 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/11 00:08
↑ヴァカの一つおぼえ

67 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/11 12:25
↑お前も

68 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/11 12:40
おいらはとにかくpcDNAをHEK293細胞にぶち込んで大量発現させます。
プレート100枚もトランスフェクションすれば十分だろ。

69 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/11 14:12
スレタイの意味が分からない

70 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/11 23:51
>>69
大腸菌も69がお好きってこと。

71 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/12 11:56
ワラ

72 :48:02/10/14 01:41
と、とれました。。
目的物は8M urea+2% SDS+boilや5% SDSにも溶けない(たまに溶けたりする)ところにいました。
発現後、可及的速やかにアグるのでPAGEのスタッキングゲルすら通過できていませんでした。
最初30分は目的分子量付近にバンドが見えるんですが、発現2時間後には全て溝に来てました。
Westernで溝がHis-Probeで肉眼で見えるほど光りまくる様は。。
(最初スタッキングゲル捨ててblotしてました)
みなさんいろいろありがとうございました。とりあえず巻直しいってみます。

73 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/14 01:44
よかったね

74 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/14 13:19
大腸菌はどうやって発現しますか?

75 :名無しゲノムのクローンさん:02/10/19 12:41
思ったより良スレage

76 :名無しゲノムのクローンさん:02/11/05 20:37
PURESYSTEM
ベンチャはじめたけど、従業員に給料払えるのかな(w
内部で働いている人のバクロ希望
ストックオプションで支払われたら困るよね


77 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/11 12:35
新スレ立ちました。こちらもよろしくお願いします。
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1016116176/l50
タンパク質の精製2

78 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 09:50
pUC18で形質転換した大腸菌を1%グルコースが入ったAm倍地で育てたら
入ってない時より全然育つのが遅くなったんですが、グルコースでblaの
発現も抑制されるからですか?

79 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/22 14:02
関係ないでしょうが、大腸菌用の1%グルコースの培地というのはどうやって・何の目的で
作るんでしょうか?

80 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/22 14:05
145 :名無しさん@お腹いっぱい。 :02/09/13 16:20
とある番組のドッキリ企画で、ユンソナの楽屋を隠しカメラで撮影していたところ、
ユンソナが突然オナニーしはじめて、その企画がボツになったのは結構有名な話。

81 :山崎渉:03/01/11 13:41
(^^)

82 :山崎渉:03/01/18 13:17
(^^)

83 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/17 03:54
   

84 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/18 20:44
ストックオプションもらいました!

85 :山崎渉:03/03/13 14:04
(^^)

86 :山崎渉:03/03/13 14:13
(^^)

87 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/18 22:31
よかったね!

88 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/19 03:56
OriCプラスミドってゲノムと行動をともにするの?
細胞内には1コピーしか存在しないの?

知っている人がいたら教えて下さい。

89 :山崎渉:03/04/20 03:57
   ∧_∧
  (  ^^ )< ぬるぽ(^^)

90 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/10 03:42
sacB遺伝子をTAクローニングしたら大腸菌が生えてこなかったひといますか?

91 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/12 09:55
漏れまくリィィィィィィー!

つうか1%グルコース入れた培地でオーバーナイトしたプレカルチャーが
一番目的タンパク溜め込んでた。Cmが死んでるのか?

92 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/18 23:05
Cmはそう簡単に死なないぞ
気になるなら濃度あげてみたら?

93 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/19 00:17
ド素人でつ 質問がありまして書き込みます タンパク発現するとき、大腸菌に対して、発現した産物が毒性を持つのはどんな時なんでしょうか?それを予測できたりしますか?発現今後したいんですが、そいつがどんな方法しても発現できないって言われてるらしくて・・・

94 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/19 03:16
>>93

理由は色々あると思うけど
発現させたタンパク質が
内在性の生存に必須な因子を阻害する可能性
なんかが考えられる。
他の生物種のもの発現させるんだから
普通は起こらないけど、時に起こる。
過剰発現系ならなおさら

あとはフォールディングしないタンパク質発現したら
それだけでtoxic

95 :sage:03/05/19 03:54

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96 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/19 21:26
植物による発現の方法が開発されたそうですが、詳細をご存知の方おられますか?
昨日の日経に載っていたそうです

97 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/21 00:16
>>94
インクルージョンボディーがtoxicってことですか??

98 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/21 01:28
んなこたあない
inclusion bodyにいくお陰でガンガン発現する蛋白質はなんぼでもありまっせ

99 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/21 07:43
lacIqってクマシー染色で見えますか?
ベクターによっても量が違うんでしょうか。
IPTG添加後になくなるバンドがあるのですが……

100 :山崎渉:03/05/21 21:36
━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅(^^)]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

101 :山崎渉:03/05/21 23:15
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102 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/07 21:41
EGFP-tagの大腸菌用発現ベクターを、まずプラスミドを増やす目的で振ったらペレットが緑色だった。
漏れ過ぎ。

103 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/08 20:57
ヘルプです。大腸菌(BL21)で発現させて、ちゃんと目的蛋白だけを認識する抗体で
うえすたんしたら、ちゃんとした分子量プラスアルファ上下に同じように反応するバンドが
現れとります。単に抗体のばっく?でもこれって・・。分解で分子量が減るならまだしも、増えるって
しかも、多量体状態までじゃなくって、ほんのちょこっと増えるってなんなんだ?
くうううううううう。

104 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/08 21:06
>>103

STOPコドンがリーキーで読みとおしできているんでは?

105 :_:03/06/08 21:07
http://kame.kakiko.com/hiroyuki/jaz_b01.html

106 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/08 21:19
>>102
ってGFPって青-紫外光で緑色発光するんだろ。
普通の条件でいくらタンパク量が多くったって緑色に見えないだろう。

107 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/08 21:36
GFP=緑色蛍光蛋白
緑色蛋白にあらず、、というところか?

108 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/08 21:41
リークィー???なに?そんなことあるんだ!
チェックしてわかるもんなんだろうか?


109 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/08 22:27
>>106
日光に含まれてる紫外部だけでも十分目視で確認できるくらい
みどりになるよ、やってみそ。蛍光灯の光でも(以下同文)

110 :山崎 渉:03/07/12 12:52

 __∧_∧_
 |(  ^^ )| <寝るぽ(^^)
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 \ |⌒⌒⌒~|         山崎渉
   ~ ̄ ̄ ̄ ̄

111 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/13 02:05
バクテリアの遺伝子破壊についていい文献があったら教えてください。

112 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/13 02:34
>>106
手元の観察結果は、102、109の報告が正しいことを示しているぞ。
pEGFPにサブクローンして形質転換した時、セルフライゲーション
したプラスミドが入ったコロニーはよく観察すると、うすい緑色
であることに気づくが、目的のインサートが入ったコロニーは白色
のままなので、スクリーニングのコロニー選択に利用できるぞ。

113 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/13 02:44
>>111
グラム陰性菌かグラム陽性菌か、それとも抗酸菌か?
詳細きぼ〜ん。
ってゆ〜か、PuB-Medで検索してみなはれ。
・Molecular Microbiology誌
・Journal of Bacteriology誌
・Infection and Immunity誌
あたりに、参考文献ありまへんか?

114 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/13 11:15
>>113
グラム陰性ですが、なにかベクターを使ったほうがいいのか裸のDNAでいいのか比較した実験でもありますか?

115 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/13 14:02
>>113
方法を比較したような文献は、今まで見たことがありません。

どのような方法で、どのような欠損株を作製しようとしているのでしょうか?
それと裸のDNAというのは、目的遺伝子断片そのもののことでしょうか?

ちなみに通常の相同組換えの場合、
野生型の目的遺伝子を含む断片を、親株では複製できないようなベクターに
クローニングして、内部に挿入か欠失の変異を入れた変異型アリールを作製し、
それを親株に形質転換させます。

形質転換されたDNAと染色体の間での相同組換えが、変異の5’側と3’側で
一回づつ起こると野生型アリールと変異型アリールが置き換わるので、
そのような株をスクリーニングして分離します。

用いたtargeting vectorですが
(1)環状のまま形質転換した場合、2ステップのスクリーニング
   をすることになります。 
(2)線状にして形質転換した場合、1ステップのスクリーニング
   で済みますが、変異株がとれる確率は(1)よりかなり低くなります。


116 :115:03/07/13 14:04
>>114ですた。スマソ。

117 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/13 17:09
有難うございました。単に機能欠損株をとりたかっただけなので、PCRで増幅した断片をエレクトロポレートするだけでいけるかなあと思ったのです。環状で導入した際2ステップのスクリーニングが必要とは具体的にはどういうことでしょうか?

118 :115:03/07/14 02:06
>>117
野生型のアリールを増幅して、そのまま形質転換する、ってことですか?
その方法で変異を導入できる理屈がわからないのですが・・・??

相同組換えによる変異導入では、変異部位の両サイドでそれぞれ1回、
計2箇所で相同組換えが起こらないと入れ替わりません。
しかし、線状のまま導入すれば、1ステップで、これら2箇所で同時に
相同組換えが起こったクローンがとれますが、相当低い頻度になります。
そこで、環状のままで2回のスクリーニングを行う方がより確実で、常用
されています。


119 :115:03/07/14 02:06
>>117 (続き)

===目的変異遺伝子を環状プラスミドで形質転換した場合===
<1ステップ目>
変異を導入した部位の5’あるいは3’領域で、染色体との相同組換えが
起こると、プラスミドの全領域が一旦、染色体上に組込まれます。
プラスミドの有する薬剤耐性を指標にして、ポジティブセレクションします。
プラスミドの複製起点は、この宿主細胞内で機能できない(注1)ので、
この時点でプラスミドが染色体に組込まれたクローンのみが選択できます。
従って、このクローンの染色体上では、元々存在する野生型のアリールと、
プラスミド由来で持ち込まれた変異型のアリールがタンデムに連なった状態
で存在することになります。

<2ステップ目>
次にこのクローンを選択薬剤のない培地で培養します。すると、ある頻度で
変異部位の5’か3’のどちらかで相同組換えが起こり(注2)、プラスミド
の領域が染色体上からドロップアウトします。
この目的のクローンは薬剤耐性を失っていますから、薬剤の入ったプレート
と入っていないプレートに整列ライブラリーをつくり、薬剤感受性になって
いるクローンをネガティブセレクションします。

(注1)このようなベクターを自殺ベクターsucide vectorといいます。
(注2)最初の相同組換えと同じ側で起こると変異型アリールがドロップし
    元の株に戻り、反対側で起こると野生型アリールがドロップし、
    変異が導入される。

120 :115:03/07/14 02:23
>>117
機能欠損株を作製するのが目的でしたら、1ステップで手軽にできる
方法もあります。
(1)目的遺伝子CDSの真ん中約0.5〜1 kb程度をPCRで増幅する
(2)sucide vectorにクローニングする
(3)形質転換する(環状のまま)
(4)PCRで増幅された相同領域のどこかで相同組換えが起こり
   プラスミド全領域が染色体に組込まれる
(5)ベクターの薬剤耐性でスクリーニングする

この方法だと、119で記述した<1ステップ>後と同様、プラスミド
全領域が染色体上に組込まれたままです。しかし野生型アリールは、
プラスミド領域が挿入された形で破壊されます。
1ステップで簡単ですが、
・相同領域が短いために、組換えの頻度が小さい
・遺伝子の完全な欠損ではなく、N末端側からPCRで増幅したところまでは
 正常で、そこからC末端側のない欠損タンパクが発現している
といった欠点もあるので、解析の目的に応じて使い分ける必要があります。

121 :One-step gene disruption:03/07/14 15:39
E. coliではより簡便な方法が開発されている。

K.A.Datsenko, and B.L.Wanner PNAS 97:6640-6645 (2000)
One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12
using PCR products

本方法では Lamuda PhageのRed recombination系を利用して直鎖DNAでかつ
相同領域の短い(40nt)での組替え反応が効率よく働くように工夫されている。

1.薬剤耐性遺伝子を含む挿入DNAをPCRで調整する。
2.このとき、挿入したい目的のDNA配列をプライマーに付加する(40nt)
3.Red recombinationの遺伝子をもつプラスミドを入れた菌株に対して
  electroporation法でPCR産物を形質転換させる。
4.薬剤耐性コロニーを選択する。
5.目的領域の組み込みをPCRで確認する。

この方法の利点は、PCRによって簡単に挿入するDNA領域を調製でき、
しかも希望する位置に正確に、非常に高い効率で組替えが可能であるという。
また、2キロほどのPCR産物で10kbを越す領域を組替えで置き換えることができる。
知る限りでは15kbでの成功例がある。また、組み込んだ薬剤耐性遺伝子はその両側に
FRT配列をもっているため、あとでFLP recombinaseで欠失することができるなど、
よく考えられたシステムである。

この方法を利用して、大腸菌の破壊株コレクション(KO collection)の作成が
進められ1140遺伝子破壊株がすでに作成されている(慶応大学先端生命科学研究所
 微生物工学)。

この方法はプラスミドに対しても機能するため、BACの改変などにも利用できる。

今後のDNA改変の技術として非常に役立つと思われる。



122 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/14 16:50
http://esenden.com/rank/ninki/ranklink.cgi?id=groovy

123 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/14 19:35
ご丁寧に教えていただき有難うございました。対象は大腸菌ではないのですがトライしてみたいとおもいます。


124 :_:03/07/14 19:38
http://homepage.mac.com/hiroyuki44/

125 :山崎 渉:03/07/15 12:43

 __∧_∧_
 |(  ^^ )| <寝るぽ(^^)
 |\⌒⌒⌒\
 \ |⌒⌒⌒~|         山崎渉
   ~ ̄ ̄ ̄ ̄

126 :なまえをいれてください:03/07/24 17:46
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ?(俺を買え)」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。)
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

127 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/11 15:26
ある人の酵素なのか
ヒトのある酵素なのか

まあどっちにしてもこんなやつ学術論文書くのは無理

128 :めぐみ:03/10/11 16:58
http://elife.fam.cx/a013/

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