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▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼

1 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/10 23:49
いま実験でうまくいかないことスレッドです。
グチからアドバイスまで幅広く語り合いましょう。

皆様よろしく。

パート1 全部
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/967541407/
2
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905

2 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/11 00:22
昔のネタひっぱりだして、すまそ

part1
>>519の質問
mini-prepはちゃんとできて,1.5ml LB cultureから2-3ugくらいplasmidがとれるのですが,
残りの培養液100ulをLB 100mlにいれて一晩ふやしてからmaxi-prepをするとほとんどとれません
>>523の親切レス抜粋
とれない理由は、プラスミドが落ちてしまっているからです。
mini-prepをした後の残りの培養液を大量培養しているのが原因です。
mini-prepを始めるときに、拾ったコロニーをまずマスタープレートに小さく塗って(
つまようじかピペットチップでそっとのせるだけで良いです。)から、液体培地に入れるようにします。
mini-prepして当たりのクローンを同定した後、マスタープレートからmaxi-prepのための液体培養(@)を始めれば
たいていの場合は問題が起ることはありません。
一番理想的なのはあたりのクローンのマスタープレートから当たりクローンを新しいプレートに塗り付けて半日ほど培養して
菌が増えたところで掻き取って液体培養(A)することです。

ここで疑問点。
@やAでいう、液体培養とは、
A,掻き取った菌塊をいきなり100mlLB(amp+)液体培地にぶちこめばいいということでしょうか?
B,それとも、そのまえに、5-10ml程度のpre-cultureやって、その後100ml cultureということでしょうか?

実験書の記述では、「@→AではなくB」をよく見受けます。
Aでの「当たりクローンを新しいプレートに塗り付けて半日ほど培養」ってのは、
ちょうどBのpre-cultureに相当し、Aをするなら、A→Aでかまわないということでしょうか?
Bの操作は培養時間の短縮のためやコンタミ対策には有益だが、
不適切な培養(長時間培養)では、逆に次のlarge scale cultureにも悪影響を及ぼすから、
気をつけろということでしょうか。

>>521さんに聞きたいですが、まさかそんなタイミングいいとは思えないので、
他の方でも親切な方、ご教示ください。
お願いします。

3 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/11 00:39
トリチウムちみじんでラベルしたDNA溶液のちみじん濃度を
測ろうとしてRI室へGo。
TEに溶かしたDNA溶液を液シンカクテルに添加したらDNAが
沈殿してきたんですけど。
これはDQNですか?

4 :名無しゲノムのクローンさん:02/07/11 07:46
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50

cheese natto と移転したからねえ。

5 :sage:02/08/17 09:09
トリチウムちみじんでラベルしたDNA溶液のちみじん濃度を
測ろうとしてRI室へGo。
TEに溶かしたDNA溶液を液シンカクテルに添加したらDNAが
沈殿してきたんですけど。
これはDQNですか?




6 :nana:02/08/17 09:27
>2に今さらのようにマジレスしちゃおうかなぁ。
つ〜か、重複スレ。
誰か自分のリモホ晒して削除依頼しといてね♪

7 :名無しゲノムのクローンさん:02/08/27 11:46
>>2
どっちでかまわん。

8 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/11 23:49
エタ沈のときに−80 2h か液体窒素で凍らせるのはなぜなのか知りたいです。
今日凍らせなかったのに沈殿した なんのために冷やすのですか?きになります

9 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/11 23:51
しないよ。
 

10 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/11 23:57
冷やさなくてもOKだよ。

11 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/11 23:58
冷やすと


塩も析出します。

12 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/12 00:19
冷やすのは宗教的理由からです。

13 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/12 00:19
たくさん取れた気になっていいかも。

14 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/12 00:20
冷やすより、2-ブタノールで吸水して容積を減らせ。

15 :ここどうよ?:02/09/12 00:22
http://love.2ch.net/test/read.cgi/furin/1031733731/l50

16 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/12 01:04
とてもありがとうございます。実験してるとき違うこと考えていつもミスってて
今日もがくーりしてたのでし 
みなさんありがとうございまっす

17 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/12 01:38
あれpart2は落ちたの?とおもったらあるじゃん。
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/15 22:36
ノーザンしたら、28,18SとtRNAのバンドが出てきた。
何でですか?
助けてください、シャア少佐。

19 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/16 20:47
age

20 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/24 14:21
age

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/09/24 22:16
質問です。
培養昆虫細胞にRNAをtransfectionする場合、
Reagentは何がいいのでしょうか?
あと、Capは、哺乳動物細胞と同じものでよろしいのでしょうか?
その他、特に気を付けることが会ったら、教えてください。

22 :和泉節子 ◆/06spwzA :02/09/24 23:25
うちの息子をよろしこ!

23 :.:02/09/26 00:42


24 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/04 02:51
CATB法に関して教えてください

2*CTAB,クロロホルム/イソアミルアルコール入れた後,遠心の上澄み(A)に
クロロ/イソのかわりに1*CATBを入れたのですが,その後にクロロ/イソ入れたら
この後は通常のプロトコル通りでOKなのでしょうか?

(A)にクロロ/イソを入れた後、2800でなく8000rpmぐらいでまわしています
白いペレットや二層の境界面に白いもやもやがあるのですが
これはDNAでしょうか

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/04 03:42
>24 part2の方に転載しておきます。
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50

もうしばらくあちらの方をお使いください。

26 :仕切たがり屋:02/12/10 17:36
あがりま〜す

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/10 21:01
哺乳動物用発現ベクターを組むさい、3'non coding sequence は含めないほうが
よいですか?

28 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/11 00:06
ハイブリドーマの培養上清を濃縮したいと思ってるのですが、
簡単でいい方法知りませんか?
種類がたくさんあるんで簡単な方法がいいのですが・・・

29 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/11 12:36
こちらも新スレに移行しました。よろしくお願いします。
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1016116176/l50
タンパク質の精製2


30 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/11 23:31
すいません
前スレで

-------
超遠心でgDNAを精製しました
溶媒はTE-塩化セシウムです

DNAを取り、いろいろ処理をして、下層の溶液+2倍量TE+さらにその2.5倍の100%エタノール
で-80℃30分以上しました

その後にすぐに遠心(80分)しました
そしてペレットを70%エタノールでリンスして遠心して(15分)白いペレットを得ました

遠心の温度は4度でした

白いペレットを見てふと思ったのですが
-80度から4℃遠心の間に溶液を溶かして、塩化セシウムが析出するのを確認して
それを溶かしてから遠心する、という処理が必要だったのではないか?
このペレットには塩化セシウムがかなりあって、それで白いのでは?

---------
を書いたものです

このペレットをTEに再び溶かして
100%エタノールを入れたのですが、何も沈殿は起きませんでした
遠心しても何もでませんでした
まだ救い様があるとすれば、どのステップまで戻ればよろしいでしょうか

31 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/12 05:55
950 :名無しゲノムのクローンさん :02/12/10 06:37
禿同
だからセシウム振ったあとは,一般的には透析でDNAをとります
透析しないでエタ沈したら,重たいセシウムのジャリジャリの上に
へなへな〜っとDNAが乗っているので,吸い取って捨ててしまいやすい
セシウムジャリジャリになったら7エタではセシウムを除去しきれません
いったん適当な量の水に再溶解してエタ沈をやり直すとよい
ただしとれてくるDNAはセシウム塩と思われ
酵素反応大丈夫か?

----------
を書いたものです

原因の想像
1.DNAを吸ってしまったので,もう戻れません
2.塩を入れ忘れたので,もう戻れません(残ったセシウムとTEの量にもよるが)




32 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/12 06:00
>>30
まだ上澄みを捨てていないなら
今からでも遅くないから塩を入れてみてくれ
それと何か共沈するやつも入れると安心だ



33 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/12 08:17
今日とうとう、hybond N+ のロールを一個使い切ってしまいまいた。もちろん俺一人で。

いったいいつになったら念願のあたりがとれるんだろう。。。

34 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/12 19:32
精製した蛋白100pmolをSDS-PAGEにかけて
セミドライ式ウェスタンブロットでPVDF膜に転写しましたが
N末端アミノ酸配列がどうしても読めません
N末端がブロックされているとみてよろしいでしょうか?


35 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/12 19:49
>>33
この際と思って大量に注文したメンブレンが届いて最初のスクリーニングで取れます。

36 :30:02/12/12 23:01
>31-32
レス本当にありがとうございます。
上澄みは捨ててしまいました。アホです。ハイ。
>32
入れる塩は塩化セシウムでもNaCl-TEどちらでもよいのでしょうか?

この実験は久しぶりにしたのですが、記憶の中でも、プロトコルノート見ても
透析、という作業が見当たりません。
31さんのレスポンスと少々被るのですが、セシウム塩のDNAでかまわなければ

-80℃30分→常温に戻して塩化セシウムらしきものを溶かす
→4度で遠心、ペレット回収→リンス でよいのでしょうか

DNAはPCRに使います
確かめも制限酵素で切らずに、電気泳動で短いバンドが無いのを確認して終わりだったと記憶してます

皆さんはDNA取った後(70%エタノールでリンス後)どうされてるのですか?
RNA分解酵素とTEで終わりでしょうか?
それともPEG沈殿でしょうか
それとも超遠心でしょうか

質問ばかりですみません

37 :30:02/12/12 23:05
ttp://ki-taji.hp.infoseek.co.jp/ex/cscl_g.html
で勉強します 逝って来ます

38 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/12 23:29
PCRの為に超遠心か?
おまえ20年前の人間か?

39 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/13 01:38
CsClで取ったあとエタチンするなら、5倍量の水で薄めた後、全体量のさらに
2.5倍量のエタノールを入れて(塩は不要)室温で遠心かなあ。ゲノムだから
切れるかもしれないけど、それだけでくるくるっとしたひもが出ないかなあ。

40 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/13 01:40
>38-39
ありがとうございます
>38
今はどんな感じなのでしょう?


41 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/13 04:44
>38
多糖類の多い植物なんかのDNAだといまだにセシウム振ってるやついるよ
おいしい植物はだめだねえ
簡単にはいいDNAとれない
キノコとか藻類とか

でも地上最強のDNAとれない生物
珪藻,これ最強


42 :素人素朴な疑問:02/12/13 23:49
1人で荒波にもまれて生きていくには厚い殻が必要だったのだろうか<珪藻
それとも珪酸塩を多量に含むから(?)ガラスにDNAがくっつくような原理で
DNAがとれにくいのか。
そもそもなぜ珪藻という名前なのか。素人の疑問は深まるばかりだった。

(つづく)

43 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 06:35
つづきに期待揚げ

44 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 12:08
【現行スレッド】

もの凄い勢いで誰かが質問に答えるスレ@生物板6
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1039676289/l50
▼今実験でうまくいかないこと▼パート3▼
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1026312578/l50

【沈めて保守すべきスレッド】

もの凄い勢いで誰かが質問に答えるスレ@生物板5
ttp://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1034784131/l50
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
ttp://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50


45 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 18:40
リンスのエタノールは何%まで下げられるだろうか

46 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 20:36
またライゲーション失敗した。
2chやめるしか。


47 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 20:49
30%まで。

48 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 20:50
>>45
70%まではOK。
ただそれ以下となるとやったことがないので
なんともいえない・・・

49 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/14 23:39
水とエタノール間違えてだいぶ減ったことあるぞ

50 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/15 01:20
>45 たくさんレスがあったので感激。保守されるはずのパート2がパート3より上にあってがっかり。
エタチンメイト(正体はグリコーゲン?)とかを使った後の沈殿なら、結構ガンガンに洗えるだろうか。

51 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/15 01:24
>>50
根本的にバカだろ?

52 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/15 06:59
エタ沈メイトの正体はアクリルアミドオリゴマー


53 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/15 09:27
エタチンメイトはお金がかかるので却下。
Blue Dextranを使うとぺレットに色がついてよろし。
吸光度を測る必要がないんだったらお勧め。


54 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/15 10:12
うちはエタ沈メイトを自作してます。

Gaillard C, Strauss F.
Ethanol precipitation of DNA with linear polyacrylamide as carrier.
Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25;18(2):378.
PMID: 2326177

55 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/15 15:10
うちもそれ。1回作ると5年は使える。

56 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/17 07:51
そんなものわざわざ作らなくても
PAGEの余ったのが固まったときに分離してくる
どろっとした液をシリンジで吸い取って使えば?


57 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/17 08:06
つうかキャリアーなんか使ってる奴はヘタレ

58 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/18 23:13
>>57
分かってないね。ゲルから抽出したような希薄なDNA溶液から定量的にエタ沈し
ようと思ったら、何分遠心しなかなんないか考えてみろよ。キャリアー使えば
EtOH入れてすぐ遠心3分でロスもなく回収できんだから、サブクローニングなん
かの目的なら、キャリアー使うのが正解なの。Molecular Cloningのエタ沈の
項でも読んでみろよ。

59 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/18 23:35
ヲレならキャリアー使わずに2-ブタノールで吸水して50ulまで容積を減らす。
これ最強!

60 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/19 00:17
>>58
いつの時代の人間だよ(藁

61 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/19 00:28
そういやtRNAキャリアーにして実験したときに
分光高度計つかって核酸濃度はかったことあるぜ(藁
あんときは自分のバカさ加減を腹から笑ったよ

62 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/19 00:35
Molecular Cloning とエタ沈をわらう >60 は
ゆとり教育と人間の悪い心が生み出した未来生物


63 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/19 01:15
molecular clonig の和訳ってでてるんですか?

64 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/19 02:27
だめだこりゃ

65 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/19 07:01
>前スレ951
PVDFならメタノールなくてもいける。
むしろないほうがいいらしい。
何で入れるのかは諸説こもごも。膜との疎水結合をプロモートするとか何とか。
でもニトロセルロースの場合は必要みたい。やったことないのでわからんが。

66 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/19 10:37
PVDFは前処理でメタノールに浸しておけばOKなんだろうか…

ウエスたん…ハァハァ(;*´Д`)
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1001508029/l50
にてウエスタンの実験手法にまつわる議論をお待ちしております。


67 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/19 23:36
>>60
キャリアー無しで希薄DNA溶液のエタ沈の出来る時代が来てたとは知らんかった

68 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/19 23:43
希釈DNA溶液なんか作らない実験系だもんな。今は。
カラムやらガラスビーズやら

69 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 00:17
だからって希薄溶液からのエタ沈が無くなったってこたあねえだろ。エタ沈3分(大抵は1分1)は魅力だがな。

70 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 00:20
すみません。
ちょっと質問。
アガロースゲルの切り出しのときのUVって、
ほんとにDNAに悪さするの?

71 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 00:22
UVでcloning効率が落ちるのはホントだよ。「EtBr染色→UV→切り出し」のフラグメントと、「クリスタルバイオレット染色→可視→切り出し」のフラグメントを等量使って比較したら、後者のほうが一ケタ沢山コロニーが出た。変異云々は推して知るべし。

マルチポストでスマン

72 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 00:48
∧∧ ∧∧l||l
       /⌒ヽ/⌒ヽ) ………
      〜(___〜(___)
     ''" ""''"" "'゙''` '゙ ゙゚' ''' '' ''' ゚` ゙ ゚ ゙''`

   ∧__∧         ∧__∧
   (:::::::  )l|ll ∧∧  (:::::::  )l|ll
   /:::::::ヽ   /⌒ヽ)l|ll /:::::::ヽ
  (::::::____) (  ___)  (::::::____)

  もうだめぽ・・・


73 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 01:11
>>71
クリスタルバイオレットとはなんでつか?
教えてチャンでスマソ

74 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 01:26
エタ沈は目で見えないと不安だから...

75 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 03:06
age

76 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 03:07
低融点アガロースからゲル精製してるんだけど、収率が0〜10%程度しかない…。
要らないプラスミドでやると上手く逝くので腕の問題じゃないはずなんだが…。

何が不味いんだろう?


77 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 07:03
それはヤッパ腕が悪い

78 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 08:44
感情と戦場の違いくらい考えろ

79 :>76:02/12/20 12:57
普通のアガロースで泳動して、切り出したあとパラフィルムに挟んで押しつぶせ!
フェノクロ、エタ沈でOK

80 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 13:02
>79
かっこええわー!

81 :_:02/12/20 13:08






http://sasurai.gaiax.com/home/kt2jp_sss_cttp






82 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 23:22
>>76
余裕があれば、だが。。。
キアゲンのGel Extraction Kit。
http://www.qiagen.com/catalog/auto/cget.asp?p=MinElute_QIAquick_DNA_cleanup_systems&l=jp
http://www.qiagen.com/catalog/auto/cget.asp?p=QIAEX_II_gel_extraction_system&l=jp#qiaexii_procedure
40b〜50kbまでOK。
これ使い出したらもうだめ。楽チン。でも貧乏なのであまり買えない。

実験やってると、結局金だよなぁ・・・と思う瞬間がたびたび・・・。

83 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/20 23:26
http://global.whitesnow.jp/casino.partner.toppage.txt
私の友人が先日3万ドル(360万円)当てました。(スロット)
ちなみに私の最高は1000ドル(12万円)現在までの収支は+1200ドル(スロット)
仕事が忙しくてなかなかパチ屋に行けないのですが、インターネットカジノなら24時間いつでもOK
なので、時間が無い人でも出来るってとこがGOODですね。

84 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/21 00:38
>>82
キアゲンいいね。10分で終わるし。
でも一人でやってるのに250個入りはちょっと多かったよ。

85 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/22 07:33
スピンカラムでゲル精製していますが、回収サンプルの濃度をなるべく高くしたい
場合、後からエタ沈をするしかないでしょうか。
グラスミルクだと溶出の液量を減らすことができたのですが…

86 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/22 07:48
濃縮遠心機で水を飛ばしちゃうのはどうですか?

87 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/22 13:59
TEでなく純水で溶出すればいいですかね。


88 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/23 01:14
>>78
要らないプラスミドは開環してから精製してるよ。。。

ゲル片を小さくしたらなんとか取れた。。。収率10%以下だけど

89 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/23 03:03
>>85
こういう場合、あまりこだわらないほうがいいと思う。
多分その後サブクローニングに移行するとおもうが、
それができるくらいの量あればいいわけで前もって多め
に流してフラグメントの量多くすればいいと思うが。

90 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/23 19:10
アグロバクテリウムに目的遺伝子の入ったプラスミド(約15Kbp)を形質転換させた後,
確認のためにアグロからプラスミドをミニプレップで精製して制限酵素処理しています.
が,どうしてもスメアになってしまいます.
制限酵素処理する前のプラスミドは分解せずに一応取れています.
酵素量は反応溶液の1/10以下にしていますし,バッファーなどのコンタミンもないのですが.
アグロを使うのは初めてです.どなたかアドバイスお願いします.


91 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/23 20:36
アグロはendogeneousなDNase量が多いからです。
フェノール処理を二回位して、
制限酵素で切る時間も短くすると改善するかもしれませんね。


92 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/24 02:15
>>84
50個入りもあるっしょ?

>>85
PromegaのWizard使えば15マイクロリットルでeluteできますよ。
収量はどれくらいだったかなぁ。カタログで確認してみ。

93 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/24 02:48
水で溶出するときは50℃ぐらいに温めておくとよいそうです。
その後遠心濃縮。

94 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/24 06:22
>92 スピンカラムの底のフィルター部分の面積によって決まるんですかね。
濃度だけでなく収量も気にしているので、多少の手間がかかっても濃縮など
で稼いでみようと思います。

95 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/24 09:34
>91
ありがとうございます。
フェノール処理は二回ほどやっていますが、
制限酵素処理はいつも一晩やってました。
時間を短くしてやってみます。


96 :名無しゲノムのクローンさん:02/12/31 00:07
キアゲンのマニュアルみなさい!>94

97 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/01 17:03
前スレ、dat落ちしたのでhtml化してもらいました

タンパク質の精製
http://page.freett.com/tondat2ch/030101-982464137.html
▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼
http://page.freett.com/tondat2ch/030101-1009340905.html

広告が出るけど我慢してやってください。

98 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/01 17:17
>97 (・∀・)イイ!!

99 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/04 22:16
T4 DNA Ligase などでライゲーションした後の産物で、つないだ部位を挟んだ領域で PCR をかけられるものでしょうか?
どうもできない気もするのですが・・・
最終的に欲しいのはサイトが付加された後のその領域だけ(さらにサブクローニングする)ので、1ステップ早くできれば
ありがたいです。


100 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/04 22:18
できるに決まってますな。
アダプターつけてPCRを日常的にやってる事を考えると

101 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/05 04:19
>100 ありがとうございます。かかるやつはかかりました。
かからなかったのはトランスフォーメーションも失敗かと思うと憂鬱です。
(急いでいたものの方がだめだった)


102 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/05 04:26
ついでなんですが、
> アダプターつけてPCRを日常的にやってる
てのは当然自分はやったことがないのですが、リン酸化リンカーとかいうのを買って使うんでしょうか。
↑のほうに書いたようなことをしたい場合に普通はそうやることなんでしょうか。


103 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/05 07:25
>102安く上げたいならリン酸化でないのもあるよ。自分でやればいい。アダプターも売ってる。二本鎖分合成頼む手もある

104 :山崎渉:03/01/11 13:31
(^^)

105 :上崎渉:03/01/13 17:58
ヽ(`д′)ノ


106 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 01:02
最近菌を扱いだした厨です
カラーセレクションを行いました
白いコロニーしか出ませんでした.
先輩にみてもらっても白しかないといわれました.
擬陽性でないとしても,こんなものなのでしょうか?
それともIPTG,X-GAL,アンピシリン等が分解しているのでしょうか
培地に加えるこれらの量は誤ってないと思います.

またこのような白いコロニーでライゲーションや形質転換が実は
上手くいってない場合,その理由は何でしょうか?
上記の試薬の分解や擬陽性以外で理由はあるのでしょうか

107 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 01:08
上手くいってることはあり得ないので、どこかで失敗してます。
理由はたくさん考えられるので、先輩に聞きながら考えて下さい

108 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 01:10
ありがとうございます
やはり白いコロニーと青いコロニーが出るものなのでしょうか

109 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 01:13
そうです。
最高に白かったときでも5%は青かったですね。

ベクターだけライゲーションしてトランスフォーメーションしたりしてみれば
まあ理由は山ほど考えられるので、いちいちあげませんが

110 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 01:35
再チャレンジ&勉強します

ただ最後にしつこい用ですみません
>ベクターだけライゲーションしてトランスフォーメーションしたりしてみれば
この時は理論的には青くなると思うのですが実際として
白くなることがあるのでしょうか?


111 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 01:38
だから、君の実験が失敗してる原因がベクターにあるなら
全部白くなるからやってみなって事。
青くなるならベクター以外が原因って解るでしょう。

112 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 06:52
とりあえずコロニーPCRでもやれば?
コロニーが少ないときは全部白ってこともあるし

最高にうまくいったときで青5%ねぇ
まあノーコメントということにしといてくださいです


113 :厨1年生:03/01/15 07:27
青いコロニーがみたいのならとりあえず何も処理していないベクターで形質転換してみては?
白いのに中に何も入ってないっていう話なのかな?

うちは青コロニーより白コロニーのほうがいつも成長が速いので最初のうちは全部白く見えます。
コロニーの大きさで大体見分けがつくので最近はIPTG/X-galを入れなくなりました。
ベクターは2種類の制限酵素で切ったあと、ゲルでフラグメントを除いてあって、だいたい青:白=
20〜50:1です。

114 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 07:55
まさかLacZ入ってないベクター使ってたりしないよな(藁
ベクターが何で、ホストが何、で目的はなんなのか(ライゲーションサンプルを突っ込んだのか
ただのプラスミドを突っ込んだのか)ぐらい書いていただけないと、なんとも言えんのだが。

115 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 17:21
カラーセレクションをやる目的がインサートが入ったかの確認だけなら、確かにコロニーPCRの方が工夫する価値があるような。
制限酵素カットやダイレクトシークエンスとの複合技も期待できるし。


116 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 20:03
>>113
ベクターを切り出して精製してるのに
青:白=20〜50:1とはなかなかの厨ですな
脱リン酸化してない?


117 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 20:36
>うちは青コロニーより白コロニーのほうがいつも成長が速いので最初のうちは全部白く見えます。
(略)
>だいたい青:白= 20〜50:1です。

それは面妖な。Antibiotics入れてないって落ちかと思いきや。

118 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 21:55
お前らさ、いい加減に、変な質問に限ってレスつけまくる癖やめたらどうだ?


119 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/15 21:57
>うちは青コロニーより白コロニーのほうがいつも成長が速いので最初のうちは全部白く見えます。
(略)

白の方が成長が早いんじゃなくて、青いヤツも最初は発色しないから
最初は全部白く見えるって
だれかつっこめよ

120 :厨1年生 :03/01/15 22:17
ほんとに遅いんだってば……

121 :桃花と直美:03/01/16 00:09
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122 :山崎渉:03/01/18 13:00
(^^)

123 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/18 17:12
118がかなり核心を突いているように思えるのだが、、、
実験がうまくいかないこと自体より、その実験でなければならないかが先に問われる場合も。

124 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/18 21:28
脱リン酸化処理したDNA末端とリン酸化された末端のライゲーションは、
リン酸化された末端同士のライゲーションに比べて効率が悪くなったり
するんでしょうか。


125 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/18 23:51
大腸菌コンピテントセルのトランスフォーメーションは、どのぐらいの量までスケールダウンできるでしょうか。
現在20ulで使っているのですが。


126 :厨1年生:03/01/19 00:32
>>124 なるよ。うまくいかなかったの?

>>125 どれぐらいの形質転換効率の時の話ですか?
20ulでコロニー何個ぐらいでてますか?それを見て決めてください。

127 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/19 07:49
てゆーか
何個コロニーがほしいんですか?
それをもとに決めてください


128 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/19 08:19
てゆーか
自前でコンピ作ったらケチらなくてもいい


129 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/19 09:23
コンピ減らすのはいいけど、
DNA溶液の容量も減らせよ。
コンピに対するDNA溶液の割合が大きくなるとコンピ液の組成がくるって
かなり効率は落ちる。
ケチりたければ、DNAをエタチンして0.5ul位に溶かせばかなりコンピはけちれる

130 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/21 23:21
すみません。
すれ違いかもしれませんが、
どなたか、cAMPやIP3の発光検出方法知りませんか?
別のスレで聞いたのですが、
知っているヒトがいませんでした。

131 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/26 00:48
>>130
GPCRか?
ごめん適当にググッただけだからチョト違うかも知れん。
ttp://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/modelpage.jsp?MODELCD=48080
ttp://www.google.co.jp/search?q=cache:VdifhAqqLHgC:lifesciences.perkinelmer.com/jp/products/AlphaScreen.asp+cAMP+%E7%99%BA%E5%85%89+%E6%A4%9C%E5%87%BA&hl=ja&ie=UTF-8&inlang=ja

Googleで「cAMP 発光 検出」とか入れて検索すると結構Hitするんだが。
なんかでっかい画像解析装置ばっか。

132 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/26 08:50
Amershamのサイトでキャンペーンやってる何かはどうですか?
cAMP検出キットで蛍光/発光を選べるとか書いてあったような

133 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/26 10:21
129はウソ。
知っている人がいなかったんじゃなく、
教えてくれる人がいなかったんだろ。

134 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/26 11:26
↑不粋な突っ込みの上に、レスの番号間違えてるバカ

135 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/27 21:27
すみません
植物です。
CTAB法などでDNAを抽出すると
核DNAと葉緑体DNAがとれますよね?
この後超遠心を行うと,核DNAと環状の葉緑体DNAが
ちがうバンドパターンを示すので,核DNAと葉緑体DNAの
ある程度の分離ができるんですよね?

136 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/27 21:59
そうですね

137 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/28 23:19
>136
葉緑体って鎖状DNAはないんですか?

138 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/30 20:45
この方面の実験技術にあまり詳しくないのですが
化学蛍光物質を使う事でバイテクでRIを使わなくて済むのですか?
この技術では、RI以外の化学物質による蛍光標識無理、とかありますか

139 :名無しゲノムのクローンさん:03/01/31 08:08
むかし、脱アイソトープ実験プロトコルってやったなぁ。
おもにDIGばっかつかってたけど。
結局像が鮮明なRIに逆戻ったが…。

140 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/02 03:46
特異的に発現する遺伝子を見つける際には
DD法よりDS法のほうがよいらしいのですが
なぜDDはだめなんでしょう?

141 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/02 12:54
俺の場合全てnonRIですませてキタから、
逆にRI実験プロトコル本が欲しい。
まったく解らん。

142 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/07 07:06
ageてみるか...


143 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/11 00:44
ちょっと質問。
みなさん、cDNAクローンはどこから発注してますか?
値段はどのくらい?

144 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/11 11:17
>>143 スレタイトル読めや・・・

145 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/11 15:21
コンピテンとセルとベクター混合 
1:42℃2分
2:on ice 2分
3:液体LB入れる
4:37℃60分shake
5:培地に塗る

培地に塗る時点でLB入れるの忘れた事に気づきました
その後LB入れて一時間振って塗ったのですが、やっぱ菌は増えないものでしょうか

こういう時って何か解決法ありますか?
LBなしで一時間振った溶液の一部を新しいコンピテントセルにベクターと同じ
要領で処理するとか。
一からPCRをして切り出すのが試薬量的に難しいので。

146 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/11 17:48
昔からアンピシリン耐性マーカーの時に熱ショック後の
インキュベーションに意味はあるのかって議論がありませんでしたっけ。
売ってるcompetent cellには熱ショック後のインキュベーションが
不要なものもありますし(QIAGENのEZ competentとか)
もう培地に塗ってしまうしかないんじゃないすか?
というか、時間的にもうそうされてるのでしょうが。

147 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/11 21:11
>>143
こんどフナコシで扱うようになる OpenBiosystems はどう?


148 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/11 21:32
LBもいれなくていい。
けど、コンピの液は大腸菌に良くないから、
最低水で薄めた方がいい。

149 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/11 23:15
>>147
けどねー、ちょっと高めなことない?
大学なんかでも1万4千円もするんだよね。

150 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/11 23:43
>>149
元のcDNA、primer何本分かと手間・時間を考えれば、自分で釣って増やすより・・・
という場合も考えられるかな。


151 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 00:55
PCRすぐにやればとれるだろ?

152 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 01:36
>>151
お前が出すようなクソ雑誌だとPCRでいいんだろうな

153 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 12:39
152氏は、厳しいお人だと思うけど、もっともかもね。
PCRで増やすのは簡単だけど、その後が大変。
大変な理由、知らないわけでないでしょW
増やしただけのクローンは決してヒトにあげないようにね。

>>150
確かにその通りだね。
Nestedまでやると、計四本のプライマーが必要になるから。
ちょうど同じ値段になるかな。

154 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 12:40
152氏は、厳しいお人だと思うけど、もっともかもね。
PCRで増やすのは簡単だけど、その後が大変。
大変な理由、知らないわけでないでしょW
増やしただけのクローンは決してヒトにあげないようにね。

>>150
確かにその通りだね。
Nestedまでやると、計四本のプライマーが必要になるから。
ちょうど同じ値段になるかな。
ただ、atccにしかないクローンだと、
住商通す事になるから3万もかかる。
他に良いルート知ってるヒトいない?

155 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 12:43
ガーン。二重カキコ。
しかも、微妙に違う。。。

156 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 13:06
agroinfiltration

タンパク質の検出ができないんですけど、本当にうまくいくの?

157 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 13:40
何の植物で、どうやってるのか知らないけど・・・・
Northernはやってみた?

158 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 14:14
pBE2113だと普通発現するはずなんだけどなぁ、、

159 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 14:27
             告  知
    【あの名場面が今年の2月22(2chの日)に降臨する】
吉野家。「大盛りねぎだくギョク」。2002年のイブの
晩に全国の 『吉野家』で繰り広げられたあの奇跡が
今回も全国に降臨する。
【ルール】
@馴れ合い禁止。(一人で来る事)
A「大盛りねぎだくギョク」を頼むこと。
B各会場ごとに指定時間厳守で現地集合。
【日時】
2003年2月22日 02:22 or 14:22 or 22:22
【会場】全国の吉野家
本スレ@祭り板.   http://live.2ch.net/test/read.cgi/festival/1042003212/
参加店舗&時間  http://www.geocities.co.jp/MusicStar-Vocal/9356/222.html
過去のレポート   http://www2.mnx.jp/carvancle/yoshigyu/


160 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 14:29
SEXがうまくいきません。

161 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 17:18
無理してしなくていいんだぞ。

162 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 19:27
Ca-phosopateで293にトランスフェクションしてみるものの、次の日には細胞が
死んでしまいます。DNAを精製してもだめでした。
塩化カルシウムの試薬をオートクレーブしたのがわるいのでしょうか、
黄色い沈澱がぷかぷかしてます、これがだめなのでしょうか?

163 :145:03/02/12 21:08
皆様レスありがとうございました
>146
はい、すでに塗りました
>148
(LB無し)遠心→上澄み捨てる→そこの菌の塊を100uLぐらいの水で
薄めて塗る でOKでしょうか?

グランドを整備するようなガラス棒で菌を塗っているのですが
24h37℃で見たらシャーレの周りにしかコロニーがありませんでした
私が塗り下手でしょうか?

164 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/12 22:10
>>148
LBがあるんならLBで薄めろ
最低500ulくらいで

塗りべたかもね。
周りから中心に集める感じで塗れ

165 :145:03/02/13 00:09
ありがとうございます
シャーレ一枚にどれくらい時間かけて塗ってるのでしょうか
先輩は塗って塗って塗り捲れで5分くらい塗った方がいいよ、という感じです

166 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 01:26
あほかい、そんなにこすりゃあ死んでしまうわい。わしなんぞススっと
ものの3秒くらいでひろげておわり

167 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 03:54
つーか、ヒートショックの時間長すぎない?
30秒もすりゃ入るだろうに。

168 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 04:00
コンピテンとセルとベクター混合 
1:42℃2分
2:on ice 2分
3:液体LB入れる
4:37℃60分shake
5:培地に塗る

かなり間違っているぞ。
コンピは解凍後ただちにDNAとmixして氷上30分
ヒートショックは42度45秒
LBを加えて37度、静置、1時間
3000rpm5分遠心して上清を除き、残った培地0.1mlに細胞を懸濁
LBプレートに素早く捲く。スプレッダーで軽く一周なぞる。

お前の先輩がただのバカだ。自分で実験書よめ。

169 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 06:02
コンピは瀕死の状態と心得ろ
とにかくヒートショックまでの間
絶対に暖めるな
それから混ぜるな(混ぜないでDNAと混ぜろ!)

LBよりSOCのほうがよいぞ
>>168
静置した方が振るよりいいのか?
はじめて聞いた
うちでは遠心濃縮する前にそのまま100μlを塗って
もう1枚に濃縮したのを塗ってる
そうするとライゲーションの出来に関わらず
どちらかのプレートが拾いやすい密度になってる



170 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 07:24
2枚に塗り分けるのもいいけど、私はわざとへたくそに
ムラができるように一枚のプレートに塗ってますよ。
プレート半分には普通に塗り広げる感覚で、もう半分には最後に
サッと表面を撫でる感覚で。

171 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 10:33
皆様ありがとうございます
>169
一部誤解を招く書き方があったかもしれません
42度でDNAとライゲーションしたベクターを菌に入れるまでは
-80℃から出してからはずっと、on iceです

この目的のプロトコルが実験書とうちの部屋では結構違う事が
判明してました。もう一度勉強します
とりあえずDNAとまぜてからのon ice時間 42度の時間
塗る時間を見直します

172 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 10:43
>>170
プチ賢い!

173 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 11:33
>>168
御前の実験法もかなり古いな

コンピは解凍後ただちにDNAとmixして氷上5分
ヒートショックは42度30秒
on ice 1分
LBを加えてただちにまく(アンピシリンなら)
播き方はだれかがいってたムラムラ方だ

174 :59:03/02/13 12:15
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175 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 21:51
本読んでみました

コンピテントセルをon iceで溶かす
プラスミド溶液加える
on ice 30-60 min静置
42℃ 30-90 sec
on ice 2min 静置
900uLSOC入れて37℃30-60min

他の先輩に聞いたらみんなプラスミド混合後ののon iceしてたし
37℃も静置だった、、、
(`Д´)ノウワァァァァァァァァン
改変法だけでなくオーソドックスなのも調べとけばよかった、、、


ところで、LB入れ忘れた >145 ですが
今日見たら白コロニーと有色コロニーがありました
有色は青というより緑なのですが、こんなもんでしょうか?

後白コロニーの何割くらいがDNA挿入プラスミド持っているものでしょうか?
DNA断片の長さによるのでしょうか?2000bpです

176 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/13 23:12
>>145 1:42℃2分

2分ってBL21とかの入りにくいやつ用の時間やね。
うちは、Am耐性で面倒くさいときはコンピとベクター混ぜて、それを37℃に温めた
プレートにそのまま塗るだけ。

>>175 青緑白

色はそんなものでは?自分では一回真っ青になったことがあったけど、再現できない。
なんでだろ〜?
白中の当たり割合はモノによるけど、7割ぐらいかなあ

177 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/14 00:19
>171
42度でDNAとライゲーションしたベクターを

なかなか真似できない方法だな

178 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/14 00:38
>177 さん
ほんますみません。あほな書き方してしまって。
ライげーションしたベクター(4℃ all night)
→このベクターをコンピテントセル溶液に入れて42℃2分
という意味です

179 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/14 06:08
4℃,o/nというのもなかなかこおばしいですな


180 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/14 06:24
バレンタイン企画!
http://homepage3.nifty.com/digikei/ten.html

181 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/14 12:20

【an an恒例『好きな男・嫌いな男』の嫌いな芸能人1位を
  2ちゃんのみんなでクサナギにしよう♪】
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あいかわらず朝鮮万歳タレントこと草g剛に
2ちゃんのみんなで『ノー モア クサナギ!!』を叩きつけちゃいましょう。
下記のananHPに行き投票をして言い訳のできないくらいの組織票を!!
嫌いな男性有名人、抱かれたくないと思う男性有名人の欄にはもちろん草g剛を。
好きな男性有名人、抱かれたいと思う男性有名人にはズンドコでお馴染みの
ババァのカリスマ氷川きよしさんでananを一気にババァ雑誌に!!
なおクサナギの名前は間違えやすいので【草g剛】←をコピペしていくとよいでしょう。
↓anan投票HP
http://anan.magazine.co.jp/topics/1360/



182 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/14 15:08
>176
ありがとございます
>179
具体的になぜ香ばしいか教えて頂けないでしょうか?
プロトコルよんでも書いてなかったので

183 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/14 22:00
4℃では酵素ほとんど働かんやろ
ライゲースは本来37℃前後でうまく働くようにできてる
そゆわけで
ブラントの場合よく室温(または24℃とか)でやるやろ
それを16℃とかでやるのは粘着末端がくっついてる確率を上げるため
漏れもEcoRIの末端の場合に12℃でやったことはあるが
さすがに4℃はなあ


184 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/14 22:44
>>178
all nightにワラタ

185 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 00:09
原法は4度O/Nでなかったかな?
昔は確かそうだったような。
最近は(といっても10年以上あるが)Ligation kitが出て便利になったな

186 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 00:16
37℃で活性が強すぎるとセルフも増えるって話ありませんでしたっけ?
4℃ overnightは自分もやることがある。
pGEM-Tキットの説明書は4℃だったような(今はversion upしてるかも)。


187 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 00:35
4℃、37℃に関して
ありがとうございます。
私の英語読解量不足だったようです。
キット(promega pGEM-T)を使用したのですが
普通コース 37℃2時間
完璧コース 4℃over night と勘違いしてました

完璧なのは37℃2時間→4度 overnightだったんですね
ありがとうございました

188 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 00:37
あ、なんか186さんと被ってしまいました、、、
37℃と書いてしまいましたが、室温、という気もしてきました
もっかいプロトコル読んできます。お騒がせしてすみません

189 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 06:55
ダフィ:落ち着いてやりゃあできる

190 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 10:28
以前part1で御世話になったものです.その節は
いろいろありがとうございました.
いまアデノウイルスがうまく増えず困っています.
ものの本によると15cm dish 3-5枚で10-10乗から
10-11乗pfuのウイルスが得られるとのことですが
軽く3-4桁低いpfuのウイルスしかとれません.
293細胞を新しいものに変えてみても同じでした.
そんなtoxicなウイルスではないはずなのですが
何かうまく増やすコツがありますか?

191 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 11:43
>187
4℃ O/Nで失敗したことはないがなー・・・。
ちなみにPromegaのpGem T-easyでだが。

192 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 12:20
古い話で恐縮だが、ラムダベクタへの挿入は4℃で2〜3日がいいのよ。週末ライゲーション。

193 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/16 13:35
そうだねっ!

194 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/21 14:08
4℃、O/Nっていうプロトコールもあるよ、一般的なのは16℃だろうけど。
酵素活性の最適温度(37℃)低い温度でやるのはセルフライゲーションを減らすため。
plasmidで普通の大きさの断片ligationだと16℃で2〜3時間くらいで反応終了。
O/Nでやっても問題はないけど、効率は変わらず。
4℃だとO/Nでやっても16℃、30分よりも反応は進まない。
ただ、セルフライゲーションは少ない、ような変わらないような・・・

195 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/21 14:19
えーと、T4リガーゼは30度を越えると不安定になるからというのと、
断片同士(3’または5’末端突出がある場合)を結合しやすくするという
理由でライゲーションは比較的低温で行なっていると記憶しているのですが・・

196 :名無しゲノムのクローンさん:03/02/21 17:14
ちょー長いインサートのときは、4度とかの方が良いのでは?

197 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/04 17:15
制限酵素切断後、ライゲーションまで時間が空く場合どう保存しておけばいいんだろうか。

198 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/04 17:17
妙なことになるかもしれないから切ってすぐ使うようにしたほうがいいんじゃない?

199 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/06 23:03
>>190
地道にシードを重ねるのが一番だと思うが。
感染→回収→再感染を3回ぐらいやってみ。

200 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/11 05:51
>>197
198の言うとおり
「宵越しの実験はしない」が鉄則

ただしブラントの場合は結構いい加減


201 :山崎渉:03/03/13 13:27
(^^)

202 :山崎渉:03/03/13 13:32
(^^)

203 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/15 11:01
シークエンスが超きたなかった

204 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/17 10:46
質問です。
アデノウイルスのpackagingって、293を使わないと駄目なの?
293Tでやってるけど、ウイルスでてこない・・
E1A,E1Bあるはずなんだけどなあ。

205 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/18 00:13
aaaa

206 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/18 00:35
>>204
つーか素直に293でやればいいじゃん。持ってないの?

207 :204:03/03/21 21:49
>206 
ごもっとも。今やってます。

208 :名無しゲノムのクローンさん:03/03/21 22:59
マウスの後期胚や新生児の組織染色をするために、頭の一部を
輪切りにして2%PFAで浸潤固定したいのですが、
その切り出しがうまくできません。
メスを使ったり、クリオスタットの刃を使ったりして切っているのですが、
組織がつぶれたり、切り口がゆがんだりしてしまいます。
かといって、頭部をまるごとPFAに浸けても固定液が浸透しないし。。。
なにかうまく切るコツがありましたら教えてください。

209 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/04 22:02
バンドを切り出し、精製した後、フェノクロ処理するとextrabandが生じることってありません?
いつもは切り出した後、確認泳動していなかったんだけど、
最近、フェノクロ前、後で確認泳動をしたところ、バンドが増えてた・・・。
なぞ。

210 ::03/04/04 22:03
---------------------------------------
これはもしかしてモロっすか?
なんでもあり?

http://www.hi-net.zaq.ne.jp/bubbs207/
---------------------------------------

211 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/08 04:41
>>209
ちょうどもとの分子量の整数倍のところにバンドでてないでつか?

212 :あぼーん:03/04/08 05:18
   ,.´ / Vヽヽ
    ! i iノノリ)) 〉
    i l l.´ヮ`ノリ <先生!こんなのがありました!
    l く/_只ヽ    
  | ̄ ̄ ̄ ̄ ̄|
http://saitama.gasuki.com/koufuku/

213 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/08 05:34
>208

脳を取り出せば浸潤する。

214 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/08 05:49
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkvp/linkvp.html
◆地球を救う◆

215 :あぼーん:03/04/08 08:16
   ,.´ / Vヽヽ
    ! i iノノリ)) 〉
    i l l.´ヮ`ノリ <先生!こんなのがありました!
    l く/_只ヽ    
  | ̄ ̄ ̄ ̄ ̄|
http://saitama.gasuki.com/koufuku/

216 :あぼーん:03/04/08 11:12
   ,.´ / Vヽヽ
    ! i iノノリ)) 〉
    i l l.´ヮ`ノリ <先生!こんなのがありました!
    l く/_只ヽ    
  | ̄ ̄ ̄ ̄ ̄|
http://saitama.gasuki.com/koufuku/

217 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/11 21:44
>>209
ちゃいますね。切り出したサイズ以下のバンドがでてまっす。
ddWにresolveしているのがいけないのか。


218 :やばすぎ:03/04/11 21:51
誰も無反応で失敗です。
http://www10.plala.or.jp/the-vsop1985/
100年後に来るよ!

219 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/11 23:39
>>217
確かに俺もddwに溶かして同じようなことがあった。
ddwに溶かすメリットは何もないから素直にTEに溶かしたら?

220 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/11 23:40
$200の全プレ有り。
http://www.gamblingfederation.com/~133207w8A/indexjp.html

こっちは$30の全プレ。ノーリスク。暇つぶしにでも。
http://www.casinoglamour.com/~1nhx/japanese/

221 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/12 01:07
>>219
細胞にtoxicなsolventは使いたくないんですよ。
NaOHでpHをあげる?いや、Naチャネルとかまずそうだし。
Trisか?あれもtoxicでしょう・・・。
なんでddWってあんなにpH低いんですかね〜。

222 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/12 04:37
>221
フェノクロ、エタ沈後にddWにdsDNAを溶かしてるの?
そらdsDNAが一本鎖に解離しちゃうよ。

大体、切り出し後に何に使うの?

223 :名無しゲノムのクローンさん :03/04/12 12:20
>222
denatureはしません。ちなみに。
self digestionはあり得る。


224 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/12 12:37
>>208

灌流固定すればいいじゃん。

225 :山崎渉:03/04/17 08:57
(^^)

226 :山崎渉:03/04/20 04:28
   ∧_∧
  (  ^^ )< ぬるぽ(^^)

227 :エチル:03/04/26 23:09
日本酒メーカーに勤めるものですが、恥ずかしながらDO素人の質問にお答えください。
い。
モロミ中の酵母の死滅率(生存率)をMBで生まれてはじめて測ろうと思い、
教科書どうりに0.01%メチレンブルー染色をやってみたつもりなのですが、
どうもうまくいきません。これ、染まった?染まってないの?
どれが死んでんだか活きてんだかわかりません。見分けられません。
染まってない?ってことは、みんな生きてる?
試しに熱処理した酵母と活性酵母を混合したサンプルでトライした所、やはり見分けられません。
MB濃度もいろいろ試したんですが、よい結果が得られませんでした。
死滅細胞はどの程度染まるんでしょうか?はっきりわかるもんなんですよね?原因は?
ちなみに水溶液は、緩衝液は作りませんでしたし、生食水でもありませんが、それが鯨飲いや原因
じゃないですよね?どうか御助けください。

228 :bloom:03/04/26 23:12
http://homepage.mac.com/ayaya16/

229 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/30 14:43
メチレンブルーの生死判定原理は細胞膜に穴が開いてたら、そこからメチレンブルー
が入って細胞質も青く染まる、というもの。細胞膜も青く染まるので、全体的にうす
青く見えることもあるが、普通は生細胞は『青い二重丸』っぽく、死細胞は「真っ青
な丸」に見えると思う。
 pHは青の発色に関係するが、判定には影響ないはずなので、全ての細胞が同じに見
えるというなら全部死んでるか全部生きてるかのどっちかだと思われ。

#あ、動物細胞の話ね。酵母でやったことないのでまず「メチレンブルーで酵母
の生死判定そのものをできるかどうか」すら知らんのだけど

 で、水溶液を使ってるっていうことだけど、酵母って真水でも死なないの?あるい
はMBの入れすぎで死んでたりとかしない?自分は動物細胞でやってたけど、MBは毒性
があるので、MB溶液にいれっぱなしにしとくと細胞がどんどん死んでいった(=MB陽性
が経時的に増える)記憶がある。ちなみに動物細胞の場合はPBSに浮遊する。浸透圧で
細胞が死んじゃうので。

 もし思い当たる事がないなら、「酵母が確実に死ぬ」方法で処理した酵母液
(できれば処理後遠心で処理液を除いておくほうが望ましいだろう)と、
「液体培地で培養した確実に生きてる」酵母液を1:1にまぜてMB処理してみ。
理論的には半分は死んだ細胞として染まるはず。それを指標にするだ。

230 :名無しゲノムのクローンさん:03/04/30 17:08
えーとお
酵母では細胞壁がまっしろしろだから、メチレンブルーじゃみわけらんないとおもうよ
酵母の死滅率を図るときには、めんどくさくてもOD既知の培養液を培地にまいて
コロニーを数えるという原始的な方法をとるのがよいと思われます。
そういえば酵母の死滅率の測定法に関しては、Rad51などのDNA修復
変異体の実験をしてる人たちが日常的に行っているんで、よい方法が
あるかもしれないよ

231 :動画直リン:03/04/30 17:12
http://homepage.mac.com/hitomi18/

232 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/01 06:59
>>209
泳動する分だけTEとかで希釈すれば、いいんじゃない?


233 :bloom:03/05/01 07:12
http://homepage.mac.com/ayaya16/

234 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/02 01:18
Gatewayってほんとにいいのかなー???

235 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/02 04:26
トリパンブルーなんてのは??
生きてるやつは染まらんし、死んでるやつは青くなるぜ。
漏れはE.coliでしかやったことないが。

236 :bloom:03/05/02 04:27
http://homepage.mac.com/ayaya16/

237 :_:03/05/02 05:17
( ´Д`)/< 先生!!こんなのを発見しますた。
http://www.yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku05.html
http://yamazaki.90.kg/zenkaku/index.html
http://www.yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku08.html
http://yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku10.html
http://www.yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku02.html
http://yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku03.html
http://www.yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku07.html
http://yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku01.html
http://www.yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku06.html
http://yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku04.html
http://www.yamazaki.90.kg/zenkaku/index.html
http://www.yamazaki.90.kg/hankaku/hankaku09.html

238 :動画直リン:03/05/02 06:27
http://homepage.mac.com/hitomi18/

239 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/13 00:24
ageとこうぜ

240 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/13 00:43
焼肉の後のタレに浮かぶ油集めがうまくいかない

241 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/13 12:15
ICR-191がわからなくて困ってるんだよね。誰か教えてー!

242 :山崎渉:03/05/21 23:30
━―━―━―━―━―━―━―━―━[JR山崎駅(^^)]━―━―━―━―━―━―━―━―━―

243 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/31 04:46
ぎょうさのたれにラー油の分散がうまくいかない


244 :名無しゲノムのクローンさん:03/05/31 16:34
>>243
界面活性剤を混ぜる。
SDSとかトライトンとか

245 :とにー:03/06/01 23:10
サザンが上手くいきません・・・。どなたか助けて下さい。
ECLのキット使ってやってます。
分裂酵母のゲノムをovernightでEcoRI digestして、1000kbほどのプローブをハイブリしてます。
プローブは野生株のゲノムをテンプレートにして、KOD plusで増やしてゲル抽してます。
正直言って悪いところが思い当たらないのですが、もう3回連続で何のバンドも検出できません。
ストラテジーを変えてもだめでした。
半年ほど前には別のサザンで問題無くできたのですが・・・。

246 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/02 05:10
横のレーンにポジコンを流す
>プローブは野生株のゲノムをテンプレートにして、KOD plusで増
やしたやつを何段階か濃度変えてな


247 :とにー:03/06/02 09:18
ごめんなさい。1000kb→1000bpでした。大ぼけです。
>横のレーンにポジコンを流す
厨ですみません、この場合のポジコンは何を流せばいいのでしょうか?
>何段階か濃度変えてな
やってみます。今まではプロトコル通りの10ng/μLしか試してませんでしたので。

248 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/02 10:12
>247
246は、今プローブとして使っている物を、濃度を振って
ポジコンとして使用しろ、と言っているんだよ。

ポジコンとプローブが同じになってしまう?
それじゃ出て当たり前だ?
だからポジコンなんだよ。

249 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/02 12:05
genonic DNAって、どうやって保存していますか?2〜3回のFreeze Thawでデグってしまう気がしますけど。


250 :直リン:03/06/02 12:25
http://homepage.mac.com/yuuka20/

251 :246:03/06/02 22:03
どこで失敗してるかをちゃんと調べろってこってす
サザンのプロセスは
0.プローブのラベル
1.泳動
2.ブロッティング
3.クロスリンク
4.ハイブリと洗い
(ノンラジオになってから途中で止められないので1つながりでやるしかない)
5.抗体反応と発光
6.感光
(化学発色だと途中モニタできて楽なのにECLなんてご苦労さん)

1と2はゲルをエチブロに染めて写真を撮るとチェックできる
3はポジコンでチェック(マーカーにλ-HindIIIでも流してλのプローブでハイブリ)
4は3と同じポジコンでもいいが,調べたい配列を流してそのプローブをかけたほうが洗いの条件などもチェックできてよい
0,5と6は4と同じポジコンでもよいが(246で書いた),ラベルしたプローブを直接メンブレンにドットブロットしてチェックすることもできる
そのやり方はたぶんECLのマニュアルに書いてあると思う

私の場合はDIGの発色系だが
キット付属のラベル済DNAを1000〜100000倍まで希釈系列を作り
メンブレンの端切れに1μLづつブロット
調べたいラベル済プローブを10000倍ぐらいに薄めて1μLブロット
クロスリンクしたら直ちに検出操作を行う(泳動とブロッティングの時間が省ける)
これでラベル効率,抗体反応,発光(発色),感光のどこに問題があるか絞り込める



252 :とにー:03/06/03 01:05
実験終わって家に帰ってきました。レス遅れてごめんなさい。
>248
フォローありがとうございます。完全に勘違いしてました・・・。
>249
分裂酵母のゲノムはTEに溶かして4℃保存してますので、凍結再融解によるデグラデーションはありません。
>251
分かりやすくレスして下さって本当に感謝しています。けれども、このレスを見る前にトランスファーを始めてしまいました。
しかも、とりあえずポジコンとしてプローブも流したのですが、10μgのオーダーまで濃度を振ってしまいました。
濃すぎですよね・・・。明日やり直します。
ECLではlabeling reagentとdetection reagentを混ぜると暗室で青色発光が確認できるとマニュアルに書いてあったので、
それで試したら大丈夫でした。試薬はへたれてないみたいです。
ドットブロットなど全く考えが及んでいなかったので、そういったところのポジコンもしっかり取ってやってみます。
DIGについてはどんな方法なのか勉強します。なんか便利そうなので。

253 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/03 23:04
>>221
そういや、DNAってpHいくつで一番安定なの?
ふつーTEはpH8.0で作ると思うんだけど、pH7.5のとかもあるし。

254 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/04 01:00
>>253
勘違いかも知らんが・・・
DNAの安定性なんて中性pH近傍ではほとんど差ないだろう。自然加水分解なんて積極的に進まんし。
TEがpH8.0なのはむしろ溶解度が高いからだったと思うが、リン酸基がマイナス電荷持つため。
余計だが、RNAの場合はアルカリ加水分解するからむしろ弱酸性で保存するのがいいし(Ambionのクエン酸バッファーがいいよ)。

255 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/04 14:17
mRNAを逆転写するときCy3を取り込ませて標識する方法あるよね。
RIの代わりにdCTPにCy標識するやつ。
アレに使うCyって、みんなどこの使ってる?
漏れいままでアマシャムの使ってたんだけど、なんか結果が安定しない。
どこの会社のがいいか教えてください。

256 :動画直リン:03/06/04 14:25
http://homepage.mac.com/hitomi18/

257 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/05 07:17
Molecular Probe社


258 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/05 17:15
●●川崎オールスター選出運動●●
板、スレ違い大変失礼いたします。
現在オールスターファン投票において、
阪神の選手が12ポジション中11ポジション1位です。
このままでは阪神に全ポジションを占拠されてしまいます。
こんな状況に一石を投じませんか?
もしあなたが阪神ファンだとしても、
この状況は異常な状況であると思われていることでしょう。

ファン投票において一番注目される先発投手部門で
現在ドラゴンズの川崎選手が1位の井川選手に
4万票差の2位と健闘しています。
阪神のオールスター独占を阻止しよう!

投票ページ  http://allstar.sanyo.co.jp/
セ・リーグ先発投手部門はドラゴンズ川崎投手(D20)へ。
投票途中経過 http://allstar.sanyo.co.jp/result/detail.html
投票は1名義につき5票まで有効です。詳しくは下記のスレッドを。

本スレ http://ex3.2ch.net/test/read.cgi/base/1054720956/

2 c h の 力 で オ ー ル ス タ ー を 変 え よ う !

259 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/05 17:29
みてね♪
http://www1.free-city.net/home/s-rf9/page004.html

260 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/05 21:09
スレ違いかも知れませんが・・
COS7にエレポレ後上清回収
final 1mM
するため 0.2mM PMSF in イソプロパノールを 10ul
入れるつもりが、50ul誤って入れてしまいました。
なんか析出してやばいと気づきPBSで薄めました。
やっぱ目的蛋白変性してますかね・・
この後ウエスタンで、糖鎖修飾の有無を酵素で確認
する予定だったんですが。

261 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/05 21:23
>>260
つーか情報の出し方が悪いから答えられんよ。

まず、エレポレが分からん。何それ?

それからイソプロパノールをどのくらいのボリュームの上精に50ul入れたのさ。
それが分からないと判断しようがないジャン。

それでも答えると析出してるのはPMSFと思われる。
それからウエスタンするなら淡白変性しようがかまわない。ただ
目的淡白がイソプロパノールで沈澱してないかどうかが問題と
思われる。

262 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/05 21:58
>>260さま
 すいません。エレクトロポレーションのことです。
 上清2mlに50ulいれちゃいました。とりあえず免疫沈降してます。
 明日の夜にはウエスタンの結果報告します。
 糖鎖切れてなければいいなっと。
 とりあえずありがとうございました。
 

263 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/05 22:11
>>262
あー2.5%入れたのね。まあ大丈夫でしょう。
しかしPMSFが沈澱してるから気をつけろよ。
PMSFの沈澱は酸性に片寄るからね。
もしSDS-Loading Buffer入れて黄色くなるようだったら
1MのTris bufferのアルカリよりのをほんの少し加えて中性にしたらいいよ。
では報告を楽しみに待つ。

264 :動画直リン:03/06/05 22:25
http://homepage.mac.com/hitomi18/

265 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/06 01:08
>255
Perkin-Elmerがお勧め。
うまくいかないのホントにメーカーのせい?中には蛍光強度の落ちたCyあるって聞いたが?
ま、200-800nMの吸光度スキャンしてみたら(1-5μMで測定)。
あと遮光&凍結保存は重要。
俺の経験では、うまくいかないのはCyよりもRNA品質、標識方法(キットか?)の可能性大。

266 :とにー:03/06/06 21:56
252です。
さんざん困ってましたが、ようやくサザン成功しました。
ポジコンとして大量に流したプローブが検出され、もしやと思って普段よりかなり長めに感光したところ、うっすらとバンドが見えました。
さらに長く感光したら(1時間)、ちゃんとバンドを検出することができました。
どうやら、今までの失敗はバンドが出ていなかったわけではなく、バンドが非常に薄かったためのようです。以前は5分程度で見えたのに・・・。
レスをくれた方々、本当にありがとうございました。
ポジコンをやらなかったら、思い違いのまま無駄に時間を過ごしてしまうところでした。
やっぱりコントロールは大事ですね。

267 :260:03/06/07 01:43
>>260
 ウエスタンは問題なくいけました。
 バンド的にも問題なさそうです。上清が薄まったのに免疫沈降の抗体
 普通に入れたんで多少バックが濃くなりましたが・・
 あの時あきらめないでよかったです。

268 :260:03/06/07 01:45
げっ
 262と260間違えてる・・
 しかも二回
 自作自演みたい。ご迷惑おかけしました。

269 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/09 21:49
>>266
> 以前は5分程度で見えたのに
ってことは,プローブ濃度が低いか,ラベルがうまくいってないんでないかい?


270 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/09 22:23
みんな誘導型ベクター使ってる?
ラックスイッチ。。。テットオン/オフ。。。
どれが一番?!

271 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/09 22:42
lacI^q?

272 :とにー:03/06/09 23:37
>>269
この間、プローブ濃度を2倍にしてやってみたんですが、相変わらず感光に1時間以上かかりました。
ですので、濃度はあまり関係ないようです。5分程度で見えたときと濃度は変えていないはずですし。
もちろん、ラベリングの操作も全く同じようにやってます。
もしかすると、ラベリング試薬が劣化してきたからかもしれませんね。
以前サザンを行ったのが半年前ですので、その可能性も充分考えられます。

ところでみなさんは、ECLのゲノムサザンで感光にどれぐらいの時間がかかりますか?

273 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/10 06:46
5kを越えるインサート
全然入りません


274 :255:03/06/10 11:49
>265
アリガ頓&遅レススマソ
PEかぁ・・・Q大の知人が「4℃保存で遮光もせずに配送してくる」
とか「どうしても標識できないので調べたらabsが0だった」とか
愚痴こぼしてるの聞いて怖くて使ってないんですが、そのへんどうでしょ?
RNAはキットでmRNA精製してるんで問題ないと思うんです。
265さんはキットはどちらのを使ってますか?
私はCyScribeってキットを使ってるんですが。

275 :265:03/06/10 12:31
>274
「4℃保存で遮光もせずに配送」のは事実、俺も最初驚いた。ただ実際abs測定したけど問題あったことはない。アレイ実験もうまくいっている。
RNA精製&標識キットはいくつか試して、今も場合によって使い分けてるよ(Ambion、Agilent、オリジナル等)。
キットでmRNA精製・・・total RNAでの18S/28S評価できてますか?あとRNA分解は良く気にするヒト多いけど、実際は精製純度も同じぐらい大事。
俺の経験談:18S/28Sは完璧⇒ DNase処理(37℃、30min)⇒ RNAダメージ
精製直後は少しぐらいならRNaseが混入していても分解しない、ただ次ぎの酵素反応で×になる。
最近では脂質や糖の混入も標識に致命的に影響するとのこと(混入有無を評価するのは困難)。
CyScribeは酵素としては悪くないと思う。ただし標識cDNA精製は良くないかも?
今、多くの研究者はQiagenで精製していると思う(total RNA精製も)。
結果が安定しないって具体的には・・・標識効率?cDNA量?cDNA鎖長?アレイ定量性?
ちなみにCyScribeはdCTPじゃなくてdUTPでなかったっけ?

276 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/10 12:35
みてね〜♪
http://www1.free-city.net/home/s-rf9/page002.html

277 :255:03/06/11 10:45
>275 素早いレス多謝!
>キットでmRNA精製・・・total RNAでの18S/28S評価できてますか?
ポリTラテックス使った培養細胞からのダイレクトmRNA精製なんで、18s/28sは
取ってないです。ほかの実験(RT−PCRとか)では平気だったんで、そのまま
普通に使ってたんですが・・・・。
>脂質や糖の混入も標識に致命的に影響するとのこと
 そうなのか・・・・勉強になります。 
>標識cDNA精製は良くないかも
 CyScribe推奨の精製キット(GFXカラム)は確かに良くないですね。バインデ
ィングバッファが劣化しやすいという話をどっかで聞きました。ので私も
Quiagenのカラム精製使ってます。
>結果が安定しない
 標識後、cDNAとしての総量はそんなに変わらないのに、abs550or650測ってみ
ると全然標識されてなかったり。なのでCy色素を疑ってたんですが、同じキット
・RNA・色素を使っても入るときと入らないときがあるのがナゾ。

 あとCyScribeはdCTPのとdUTPのがあったように思います。漏れのはcの方。

 ところで標識キットの使い分けというのは具体的にどのように使い分けている
のでしょう?あとRNAインヒビター使ってます?
 素人質問でスマソ

278 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/11 11:10
あ、アレイの人だ。
便乗質問していいでつか?

どこのアレイつかってまつか?
味連とのcDNAアレイ使ってるんだけど、業者が強力にオリゴアレイ勧めてくるんですが
アレってモノはどうなんでしょ?

279 :YahooBB219001164210.bbtec.net:03/06/11 13:51
vvvvv20歳はイケイケ http://.jp/staff/in.cgi?id=10528
http://e-yume.ktplan.jp/39792489/ ]


280 :265:03/06/12 00:10
>277
RT-PCRは参考になんないよ。28,18Sピーク全く見えないRNAでRT-PCRやったことあるが、多くの場合かなりの産物はできる。
難しい状況だけど、系が安定してないってことね。可能性ありすぎるけど、やはりRNAサンプルの可能性が大。
cDNA総量よりもむしろ鎖長が大事だが、どうだろうか?アヂレントRNA分析器あればベストだが、無ければゲルで確認するしかないな(面倒&低感度だけど)。
実験系悪いと3'近傍の短いcDNAしかできなくて取り込まれない場合もあるみたい(総量は多くても)。長さ&量も問題なければCyが積極的に嫌われていることになるか。
標識キットの使い分け・・・一番の理由は複数メーカーのアレイを使ってるから、アレイ指定のキット使ってるから。おかげで色々プロトコル勉強になったのでキット指定のないアレイには目的に応じて組み合わせたり(遊んでみたり)。
最近はアンビーオンが気に入って主に使用。が、278にも関係するが、アヂレントアレイが気に入ったのでアヂレントは専用キットを使用。RNAインヒビターは一応入れているけど、オマジナイだろうな。むしろRNAサンプルから一切のRNase活性を除去する方が大事かと。

281 :265 :03/06/12 00:18
>277
アヂレントのオリゴ、ちょうど今検討中だが(多分)品質は最高。ただ金がかかる。あと増幅系RNA標識だから条件はcDNAの直接標識よりシビア。今日も標識系の条件検討して遅くなってしまった。
2色ガラススライドタイプでの俺の好み(&推測):
アヂレント・オリゴ > アヂレント・cDNA&コードりんぐ・オリゴ >>> エースgene(?)&クロウテック >>> ダカラ


282 :265:03/06/12 00:29
訂正
281の
>277

>278
の間違い。


283 :277:03/06/12 20:59
>280
度々アリガd。
RNA精製やり直してみまつ。
totalRNAだと純度で1.7-1.8位だったんでいいやと思ってそのままやってたのがいけなかったかな?
アンビオンいいですか。お金のあるときにでも試してみます。

あと、あぢれんとの標識キットはインビトロジェンが作ってるって聞きました。
あんま関係ないけど。

284 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/13 00:34
そういやインビトロジェンはS.S.III、販売してるけど実際IIよりいいいの?
最近、S.S.III使ったアレイ用間接標識キットも出したみたいだけど。

285 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/13 01:02
アレイのスレでやってほしい。

286 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/16 17:19
「CD1-mouse」ってなんですか?


287 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/16 18:38
ICRマウスは知ってる?
CD1-mouseと同じだよ。
日本ではICRで名前が通っているけど、米ではCD1。
論文とかでもCD1と記載されているほうが多いよ。

288 :名無しゲノムのクローンさん:03/06/17 13:31
ハツカネズミのことなんですね。
読んでる論文に出てきて、
いろいろ調べていたとこなんです。
どうもありがとうございました。


289 :山崎 渉:03/07/12 12:47

 __∧_∧_
 |(  ^^ )| <寝るぽ(^^)
 |\⌒⌒⌒\
 \ |⌒⌒⌒~|         山崎渉
   ~ ̄ ̄ ̄ ̄

290 :山崎 渉:03/07/15 12:52

 __∧_∧_
 |(  ^^ )| <寝るぽ(^^)
 |\⌒⌒⌒\
 \ |⌒⌒⌒~|         山崎渉
   ~ ̄ ̄ ̄ ̄

291 :なまえをいれてください:03/07/24 17:23
ハッキリ言ってアメリカなどの多民族国家では黒人の方がアジア人よりもずっと立場は上だよ。
貧弱で弱弱しく、アグレッシブさに欠け、醜いアジア人は黒人のストレス解消のいい的。
黒人は有名スポーツ選手、ミュージシャンを多数輩出してるし、アジア人はかなり彼らに見下されている。
(黒人は白人には頭があがらないため日系料理天などの日本人店員相手に威張り散らしてストレス解消する。
また、日本女はすぐヤラせてくれる肉便器としてとおっている。
「○ドルでどうだ?(俺を買え)」と逆売春を持ちかける黒人男性も多い。)
彼らの見ていないところでこそこそ陰口しか叩けない日本人は滑稽。

292 :素人:03/07/29 12:27
恥ずかしい質問させてください
forskorinとBr-cAMPを使ってACやcAMPが某mRNAの発現調節をしてる
かってのを試てるんですが、なかなか安定した成績が得られない。
FSKは10μM以下、Br-cAMPは1mM以下で濃度を変えながらやってるんですが。
使っているのはmouseのthymusのprimary culture。
先ず知りたいのは刺激法で浮遊細胞なので短時間の刺激ではなく、
FSK、Br-cAMPに暴露しっぱなしで3〜24時間後の発現を見てるんですが、
単層培養では短時間の刺激でメディウム換えて、72時間後を見たほうがよい
見たいな報告もあって、浮遊細胞でも培地交換したほうがいいのか悩んで
ます。FSKなどの使い方に詳しい方、教えていただけませんか?


293 :_:03/07/29 12:28
http://homepage.mac.com/hiroyuki44/hankaku08.html

294 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/29 13:35
>292
細胞死んでない?
FSKにそんなに曝して大丈夫?

それと、刺激時間は何が見たいかによるとおもうが?
生体内でのモデルとし実験してるんでしょ?
プライマリー使ってるぐらいなんだし。
そしたら、生体内での状態に近い条件にすべき。

295 :素人:03/07/29 14:55
レス深謝。確かに10uMではviabilityが激減してます。通常の刺激時間が15分とか
せいぜい1時間とかなのは毒性によるものなんですか?では、培地がえは必要不可欠
ですね・・・?あと、生体内の状態としては、McCune-AlbrightみたいにACが慢性
的に刺激されている状態を想定しているので、培地をほって置いたんです。Br-
cAMPでしか反応がないのも毒性のためだったのかなあ(嘆)。

296 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/29 15:18
☆無修正画像&サンプルムービーをどうぞ!!☆
http://yahooo.s2.x-beat.com/linkv/linkv.html

297 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/29 16:02
>295
FSKの毒性というよりは、PKAが持続的に活性化されることによって、
細胞内環境が異常な状態になるのではないかと思います。

アデニレートサイクレースが持続的に活性化?!
それは難しいね。。。FSKの濃度を下げてみては?
0.1とかでも結構効くよ。

298 :名無しゲノムのクローンさん:03/07/29 23:30
アグロバクテリウムを使ってイネの形質転換体の作出を行っています.
アグロバクテリウムはEHA101系統,ベクターにはpBI121を用いています.
形質転換を行うときの,アグロバクテリウムの濃度と処理時間を教えて頂きたいのです.
論文によってはOD600が0.15〜0.2と書いてあるものから,1というものもあり,
時間は数分というものから,10〜15分などけっこう幅があるようです.
もちろんアグロバクテリウムの系統や,品種によって違うとは思いますが.
経験者の方,ご存知の方はよろしくお願いします.







299 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/18 09:58
良スレage

300 :ラボの下っ端:03/08/18 20:11
お、あがってる。

もしフローサイトメーター使ってる人いたら情報ぷりーず。
WinMDIでtextにsaveしたものが何を表しているのかさっぱりわからない…
他の解析ソフトの値と1桁違ったり、かと思えば2桁以上だったり。
大きいデータはみんな1023になっちまうし。はぁ。。
愚痴でスマソ


301 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/19 00:38
まったく知らないんだが、1023というのは10ビットで割り振れる最大の値で、
つまり振り切れてるということでは?
レンジの設定がもんだいかも。
そんなのわかってるってんならすまそ。

302 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/19 01:08
odはいかに元気なアグロを取るかのため。
稲はたーっぷりと漬けた方がいいぞー。
結構、スカが多いからなー

303 : ◆gRDEQwu9i2 :03/08/20 21:53
植物からのDNA抽出についてなんですが、
何度フェノクロ処理をしても水層が緑色なんです。。。
エタ沈やイソプロ沈をして出てくるDNAも緑色。
それを溶かしたら、やっぱり緑の液体。
サザンに使いたいのですが白いDNAじゃないと、なんか心配で。
緑を除く方法もしくは緑でも大丈夫という情報待ってます!

304 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/20 21:57
やってみるべし。つーかえたちんしてんの?

305 :直リン:03/08/20 22:09
http://homepage.mac.com/kayo16/

306 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/20 22:33
緑ってのは絶対ヘンだよ。
手順合ってる?

307 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/20 22:38
>303
フェノクロやエタ沈なんて実は大した精製になってない。
カラム系で精製すれば多分、大丈夫じゃないかな?
ちょっと金がかかるのと、サザン用には分解が心配だが、
最近ではgenomic DNA精製用カラムも販売されてる。

植物は専門外なんで緑色の原因物質は不明だけど、一部ゲルに流して正常に流れてるんだったら、
ハイブリには問題ないと思うが。
アガロースのような不純物かつEtBr結合状態でもハイブリできんだから。
問題は酵素切断が可能か否かだな。

308 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/20 23:03
クロロフィルはメタノールに溶けやすい。

309 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/21 01:51
>>303
308氏の指摘どおり、緑色の物質はクロロフィルでは?
昔、学生実習で、アセトンとメタノールで抽出した
ような記憶があります。

310 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/21 01:55
>>303
下記HPなどご参考に。
「北海道大学大学院農学研究科 作物栄養学研究室における
 分子生物学実験技術を確立することを目的に運営しています。
 研究室の性格上、イネやタバコなど主に植物を対象としています。」
 http://page.freett.com/junw/MB/content.html

311 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/21 02:00
>>303
『Current Protocol』には、植物からのGenomic DNA精製法として
「CTAB法」が紹介されていたと思います。CTABで処理することに
よって脂溶性成分を除去することができるので、このステップで
クロロフィルも除去可能なのではないかと思います。

(植物は専門ではにので、間違っていたらスマソです。。。)

312 :303 ◆gRDEQwu9i2 :03/08/21 15:58
いろいろな回答ありがとうございました。
糸状菌からのDNA抽出法を植物に応用させようとしたのがまずかったみたいです。
またCTABも試してはいたのですがエッペンスケールでやっていたのがいけなかったようです。
スケールを大きくしてファルコンで行ったところ、白とまではいきませんが
少し茶色い程度のDNAがとれました。
やっぱり、植物には植物の手法ですね。。。

御指摘に従い、試しにメタノ−ル沈澱を行ってみましたが出てきたDNAはやはり緑でした。
メタノールよりもDNAとの結合が強いみたいです。



313 :名無しゲノムのクローンさん:03/08/30 01:05
>>312
むかし黒いRNAからライブラリー作ったけど大丈夫だったよ。

314 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/01 20:33
ageとくかな


315 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/01 21:40
>>303

僕もマウスの尻尾のDNA、茶色かったり黒かったりするんだよな。

316 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/01 22:57
ショウジョウバエのDNAは赤いよ。

317 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/15 01:56
組換え酵母のタンパク発現がうまくいかない・・・かれこれ1ヶ月半。
ゲノムPCRでインサートチェックもしたけど、どうにも出ない〜。
とりあえずグチっとく。
何かアドバイス欲しいけど、何を聞けばいいのか途方に暮れてます。

318 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/15 02:47

おまえら「DNAが黒い」とか「DNAが赤い」とか言うなよ
共沈したかくっついてるだけなんだから

319 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/15 02:48

目的がタンパク質発現なら別の系を試してみたら?

320 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/15 08:10
>>318
あたりまえだろ、上の誰もDNA自身に色が着いてるなんて思っちゃいねえよ。

321 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/15 08:15
>>317 発現は何で確認してる?epitope tagに対するWesternでも検出で
きないなら相当な重症だけど、CBB染色でバンドが見えないっていうな
ら、良くあることだよ。そこまで派手に発現する方がむしろ稀。プロモー
ターを強いものに代えるか、コピー数を上げる努力をするか。試行錯誤し
かないよ。

322 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/15 21:46
>>320
果たしてそう断言できるかな

323 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/15 21:51

手が震えるので、境界やフェノール層を3割ほど吸ってしまいます。
以前には32Pなんかがピッと飛んだりしてました

324 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/15 22:03
頭が悪くなって何も覚えられない・・・。
もうだめぽ・・・

325 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/15 22:06
>317
出芽酵母だったら、PCRでGAL1p-3HA-target gene のPCRフラグメントを作って
transformationするシステムがあるではないですか。それでやってみたら?
分裂や他の酵母でそのシステムが動くかはしらないし、もしそれでやっててだめだったらゴメン。

326 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/16 16:20
ガン細胞で複製系の実験してるんですけど、プラスミドが複製するのに
EBVとEBNA-1が関与してるってどういうことなんでしょうか?

327 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/16 21:38
>326
複製じゃなくて、確かプラスミドの分配に必要だったはず。

328 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/16 21:55
>327さん
プラスミドの分配に必要なんですか、ありがとうございます

329 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 08:20
クリスタルバイオレットって使ったことないんだけど、
アガロースゲルで泳動したDNAを後染めすればええの?
濃度とか分からないんだけど、MolecularCloningとかにプロトコルある?

330 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 16:44
今、BamH1で切れるようにプライマーをデザインしたPCR産物とベクターとの
ライゲーションで困っています。初歩的な事でつまずいてるようなきがするのですが、助けてください。
1:ベクターは、BamH1とBgl2で切断後、BAPにて脱リン酸化し泳動して切り出し
2:インサート:BamH1で切れるようにプライマーをデザインしたPCR産物を、BamH1にて処理後、泳動して切り出し。

両者のライゲーション・大腸菌への導入の結果、ベクターのみの ライゲーションから20個ほどコロニーあり、ベクタ+インサートからは、50個以上コロニーが生えました。ところが、セルフライゲーションばっかりです。
BAP処理が足りないのか、PCR産物に問題があるのか、、、。
何か根本的な事をわすれているのか。一人でやっているもんでわからない事ばかりです。
宜しくお願いします。

331 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 17:04
Bamのはじっこに余分に何個つけてる?

332 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 17:21
2個つけてます。一応、NEBのカタログは見ました。

333 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 17:29

BamH IとBgl IIは切断後の5'突出の配列が同じだから、
ベクターをBamHI,BglII切断したら、セルフライゲーションしやすいのは
あたりまえ。BAP処理しても、僅かにリン酸基が残っている分子がセルフライゲーションする。

下手くそならBamHI-EcoRIとかBamHI-Xholとかでやれ。

でも、BamHi-BamHIの断片を挿入する場合でも、インサートを
大過剰にしておけばベクターをBAP処理しなくても入ることは入る。


334 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 17:30
PCR産物見た?
Gel extはどういう方法?

335 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 17:51
333さんへ:組み込むベクターの関係で、3’側にBamH1、インサートの5’側
にMCSがありその最後がBamH1サイトでした。結果、両方BamHとなってしまいました。

334さんへ:一応、PCR直後、ゲル回収後にもう一度泳動して確認はしてあります。回収方法は、ゲルを凍らせてカラムで回収しています。


336 :331=334:03/09/17 19:47
BAP処理に下手もなにもないよ。たぶん。

オレが一番疑うのはGelExtの方法。
その方法はかなり効率悪い。
Insertかなり増やさないと入らないよ。

337 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 20:03
お返事有り難うございます。
一応、モル比で、ベクター:インサートが1:3でライゲーションしています。
もっと、比率をあげて後、BAPも増やした方がいいのでしょうか。



338 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 20:28
>337
こんどライゲーションする時、反応系からインサートを除いたのも同時にやっとくと
セルフライゲーションの率をみることができるよ。
ベクターがわはちゃんと切れてるのかなあ。


339 :331=334:03/09/17 20:35
ベクターのみでは20個なんでしょ?
それぐらいのバックはでるよ。
上手にやってもね。
BAPはうまく行ってると思う。
もちろん、バックをゼロにする事も可能だけどね。
RE処理やBAPがうまくいってないのなら、
20個どころでは済まない。
GelExtのキット変えてみるのもいいと思う。


340 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 20:50
余裕があればインサートの量比をふってみればいいんじゃない?


341 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 20:52
ヲレは切り出したアガロースゲルをパラフィルムの間に挟んで押しつぶして
しみ出た溶液をフェノール、クロロフォルム処理してエタ沈してる。
回収率も精製度もライゲーション効率も問題ない。キットなど使わない。

342 :331=334:03/09/17 20:57
>341
フェノクロエタ沈するならキットは不要だね

343 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 21:59
>>342
俺はキット使った後にフェノクロエタ沈やってるんだけど、意味ないのかな??

344 :331=334:03/09/17 22:05
>343
意味ない事はないと思うけど、そんなに効率変わらないかもね。
でも、精製度の悪いキットの場合は大いに意味あると思う。

345 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 22:41
>>333見ればBAP処理がそれなりにいってるのは分かる。
だからBAP処理は問題ない。
でもセルフライゲーションと思わしき結果で出てるのが気になる。
しかし、セルフライゲーションとだと結論付けた理由は何だろう?
それが気になる。

えーともっともこういった問題はここでは解決しづらいから最終的には
一人でがんばれとしかいえないけど。

346 :345:03/09/17 22:42
ゴメン、>>333ではなく>>330ね。

347 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/17 23:42
ベクターのBamHIとBglIIの距離が近すぎると切れないかもね。
pSG5とか。

348 :347:03/09/18 00:05
すまそ、あんまり本質的では無いわな

349 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/18 06:15
>>348
それでも、インサートがちゃんと切れてれば入るはずだ罠。
さんざんガイシュツだけどインサートの制限酵素処理とかゲル抽後の精製具合を疑うべきじゃなかろうか。

馬鹿馬鹿しいと思うかもしれないけど、私はPCRしたあと一回TOPOとかにクローニングしてる。
これなら制限酵素で切れないと言うことはないし、シークエンスも楽なので。
金がないとつらいけど。

350 :349:03/09/18 06:19
あ、あとBAP処理を長くやりすぎても駄目。
取説に一時間が限度だと書いてあった気がする。


351 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/18 07:13
宵越しの実験をしていませんか?
粘着末端のあるベクターやインサートは
早く傷むから
さっさとライゲーションしないとだめ
凍結融解なんてもってのほか


352 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/18 14:33
330です。みなさん、ご返答有り難うございます。
1番疑われるのは、インサートの不具合みたいです。
PCR精製物がうまくいっているか否かは、最後までしてみないと分からない
のが難点(今回、泳動上は絶えず確認可能)です。
まずは、ゲル抽出後に、フェノ・エタ沈でしょうか。
うーん、先は長そうだ、、、。

351さんへ:ライゲーションは朝から始めて夕方にtransformationしました。
宵越しはさけるようにしているつもりなのですが。


353 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/18 15:12
>350
その心を聞かせて欲しい。

>351
そんな事ないだろう?
少しは傷むと思うが。。。

354 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/18 15:28
へんな事態に直面しました。
ligationした、コロニーをminiprep.後、制限酵素で処理したところ、
切れるはずの酵素(EcoR1とBamH1)できれません。ベクター作成時に、
いじってない部分にあるはずの部分なのですが。切れなかったコロニーは
2種類まったく同じコロニーでした。また、きちんと切れたコロニーも
切れるものは全く同一由来でした。キットはキアゲンスピンカラムを使っています。
こんな事ってあるのかなー。

355 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/18 16:42
写真もって直接相談に来てくれ

356 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/18 20:48
>>351そんなことねえよ。オレは5年前に調製して-20℃にとってあるBamHI-digestedのベクターを今でも問題なく使ってるよ。

357 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 00:16
>>354
変なクローンは気にするな。
ちゃんと出来てるクローンがあるんだから。

358 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 03:01
>>354
漏れもへんな事態に直面したことあるぞ
pUC18由来のlacZを組み込んだ6 kbのvectorのMCSをKpn IとXba Iでcutして、
4 kbのPCR産物をligationしたら、10 kbのproductができるはずなのに
白コロニーをいくら拾っても、何故か2-3 kb程度のplasmidしか得られない
(ちなみにhostはDH5alpha株)
対照として、vectorを1 cutしてself ligationしただけでも、青コロニーに
混じって出現するこの白コロニーの正体って、一体何???
(サテライトを伴うので、ampicillin耐性遺伝子を有しているのは間違いなさそう)
宿主菌体内で想定外の組み換えが起こってしまったりしてるのかなぁ???


359 :358:03/09/19 04:40
>>353
スマソ、どこで読んだか忘れた。調べておきます。

>>354, 358
プラスミド溶かしてる水かTE、もしくはコンピのコンタミの可能性蟻。
358の場合は、それプラスligationがいってない、の結果と思われ。

360 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 05:03
>>359
vector調整したKitやコンピのLotを変えても再現性ありあり
self ligationはちゃんとするからLigation試薬は正常
non-ligationの陰性対照ではコロニーは全く出現しないから
コンタミでもないと思われ・・・
という状況なのでつ   あ〜鬱

361 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 07:31
>>358
そらあーた
ダブルダイジェスチョンしたら
セルフライゲーションの産物は白くて当然
末端が合わなくても
1本鎖は壊れやすいから適当に壊れてブラントになったり
KpnとXbaなら3末と5末の突出末端同士
1本鎖のライゲーションがちょっとは起きる

6kのベクターなのに2・3kというのはわからんが


362 :358:03/09/19 10:30
>>361、359さんレス サンキュでつ

それが、1 cutしたvectorをself ligationしただけの
対照群でも10%くらいの割合で、(青コロニーに混じって)
白コロニーが出現するんでつ
しかもサイズが異様に小さい・・・(元vectorのccc formは
約4 kbの位置にバンドが出るのに、この白いコロニーから
とれたplasmidは1.5-2 kbの位置にバンドが出る・・・)

363 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 18:02
42度heat shock忘れた事に今気付いた。鬱だ・・。

364 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 18:30
>>363
しなくてもうまく行く時は行くよ。

365 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 20:07

20μl〜500μlの液体を一箇所の入り口から注入もしくは吸引して
8連で分注できるピペッタがほしいです。

366 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 20:08
あれれ?92℃で熱ショックしちゃったよ

367 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 20:12
>>366
それは死んでると思う。

368 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 20:25
俺のサーマルサイクラを形質転換に使った罰だ
お前の菌などこうしてくれるわ

369 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 20:29
42℃の熱衝撃を人にやらせてるわけでもないのに
時間までストップウォッチで計ってすごく厳密にやってる人いるよね
俺は一応頭の中で数えてるけど

370 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/19 20:31
>>366
熱鉱床に棲んでる菌にはいい湯だね

371 :名無しゲノムのクローンさん :03/09/19 20:46
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安心して買い物できるDVD屋です。
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372 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/20 05:46
>>358
使ったプラスミドに、cccで1.5-2k ぐらいのlacじゃないプラスミドがコンタミしてるとか。
グリセロールストックからシングルコロニー拾って、プラスミド取り直してみたら?
あと、Blue/White見るときに、判断下す前に一度冷蔵庫に放り込んで数時間放置しておくと、
白かったコロニーが青くなってたりすることがある。
まあ、この場合は違うんだろうけど。

373 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/20 06:48
test

374 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/20 07:53
白コロニー拾ったのに
シーケンスしたらMCSそのままってのはよくある

入りにくいインサートの場合は特にな



375 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/20 20:55
2DEで展開した蛋白のスポット拾ってきて、in-gelトリプシン消化しても
MSでアルギニンやリジンのピークはおろか、トリプシンの自己消化物も
出ないんだよね・・・。
やっぱりアルキル化って必須?

376 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/21 02:36
372さん レスありがとうございます
保存してあるプラスミドの古いLotを形質転換してみて青いシングルコロニーから取り直してみます
その時点で白コロニーが出るようなら、何か別のプラスミドが混じっていたということでしょうね
偽陽性は、ミニプレ用の液体培養と同時に新しい平板に整列ライブラリを作って翌日再チェックして
ますが、そんなてっとり早い判別方法もあるんですね

374さん
先日5.6 kbのPCR産物をクローニングしましたが、4つの白コロニーのうち
1つだけが当たりでした(これでも運がいい方だと思いますが)
今回は4 kbだったのでそこまで苦労しないと思ってたのですが、、、
1.5 kbくらいまでなら、ほとんどハズレないんですけどねぇ


377 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/21 02:44

大学のラボってのんびりしてるなあ・・・
実験スピードの遅さが信じられない

378 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/21 18:44
うちのM2どもは9/20-9/23の4連休のようです(怒

379 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/22 00:05
>375
アルキル化、したほうがいいのは確かだけど、それほどクリティカルでもないよ。
とりあえず何かしらピークは出るはず。

380 :317:03/09/22 00:28
組換え酵母でタンパク出ない、と言っていた317です。
グチだったのでレスも付かないと思い見ていませんでしたが、
レスくださった方々、ありがとうございました。

今日ついに成功、SDS-PAGEで発現確認できました。
培養温度が効いていたようで、20℃まで下げたら出てきました。
今までやってた一番低い温度が23℃だったんです。甘かった。

おかげで修論に間に合いそうな、M2でした。

381 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/22 07:47
>>377
教育兼ねてるから・・・
予備試験や試行錯誤ならともかく、4年生だとしょうもないミスで
やり直しってのが意外と多いし
修練と経験積んだベテランばかりで構成されている企業や
研究所と対等のスピードってわけにはいかんでしょ
そう考えると、大学に研究成果だけで格差つけるのは理不尽な気が
してきた・・・ いかに良い人材を企業や研究所に提供しているか、
という基準も必要かと。

だけど再三ポジコン・ネガコンおけっていう人の指導無視して実験して
挙句上手くいかない結果をもってきて、「どこが悪いんでしょう?」
って聞くのはいいかげん勘弁してほしい・・・

382 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/22 21:41

そうじゃなくてよくサボってんじゃん
大学時代は(俺自身じゃなくて)周りのサボってる風景が当たり前に見えたが
企業の研究所なんて昼休み以外動かないときはない
「いま機械動かしてるからちょっとキューケー」なんて存在しない

コントロールは置けって命じるよりもその意味をきちんと教えてあげればいい
理屈を教えたら理解できないほど馬鹿が入ってくるとも思えないし
面倒だから「そのうちああそうかとわかるから、とにかくやれ」とか言う人もいるけど
本当は先に理由と重要性を教えたほうがいい

383 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/23 02:57
>>382 その割には企業で大した仕事が出てるわけじゃないんだから、結局のところあんたの言ってるのは低いレベルの話で、つまりは誤差範囲なんじゃない?

384 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/23 07:50
>>383
企業と大学とでは目的が違う。
そんな当然のことが本当にわからないで言ってるなら馬鹿だなあ。

385 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/23 08:03
あぁ、そもそもの>>337の発言が「 企業と大学とでは目的が違う」ってことを踏まえていないのが問題なのに、 そんな当然のことが本当にわからないで言ってるなら馬鹿だなあ。


386 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/23 18:42
遅くていい目的などない
本当に馬鹿だなあ

387 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/24 03:09
それでメシ食ってる人間とそうでない人間を同列に並べるなよ。

388 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/24 20:55
ちゃっちゃとやれない奴は大学であっても研究辞めればいいのに・・・
実際にそういう学生が多いから邪魔。
機械だけは占有するし。

389 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/24 22:38
まあまあ、大器晩成というから… 就職してから>>377みたいな大口を叩けるようになる奴も出るみたいだから、まあ大目に見てやってよ。

390 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/24 22:46
プププ
388に377のことでレス

391 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/24 22:57
というか一年上にもトロいのがいるんだが邪魔。
時間掛けて機械占有するし
思わず「そこどけ、アメやるから」とは言わなかったが
こんな奴が大器晩成とは思えん。
実験以外ではゼミのミーティングでも要領得ないし。
こいつラボ出ると動きが速いんだが
そんなに研究嫌なら頼むから出てこないでくれ。
ただただ邪魔。

392 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/24 23:33
漏れは亀教授が邪魔だな
トロいし、アポだし

393 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/29 22:07
細胞培養でスケールアップしたくて 回転培養にしたんだけど
回転培養のボトルの壁に細胞くっつくんだよなぁ
いいのかなぁ 浮遊培養のように培地のなかで増えるもんだと
おもってたんだけど・・ 細胞は Flp-in 293細胞です。
どなたか いい方法があれば教えてください。

394 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/30 08:38
もし、その細胞が足場依存性だったらしょうがないと思うぞ。

395 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/30 09:35
>>393
マルチ逝ってよし

396 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/30 09:42
>>393
馴化が必要だろ。
http://www.isjpn.co.jp/tc/v-series/99278.htm

397 :名無しゲノムのクローンさん:03/09/30 10:24
ネット繋ぎ放題で低価格超高速な香具師part2
http://ex.2ch.net/test/read.cgi/entrance/1064817485/l50

学校の端末から節穴をしたことで個人情報が
かなり危うい危機にさられてる可哀相な>>1がいます

398 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/02 17:35
real-time PCR使ってます
どなたか使ってる人いませんでしょうか?


399 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/02 17:43
330です。
一応、解決したようです。
具体的には、たまたま、TOPOクローニングキットがあり、
PCR産物を組み込んだ後、BamH1で処理して、きちんと切れた
ところから、ゲル回収しインサートとしました。
これらから、PCR産物の制限酵素処理がうまくいっていない事が推測されました。余分に、2個ほどつけたのですが。プライマーは何merまでのばせるのでしょうか??やっぱりTOPOの課程で時間食いますから。
レスいただいた方、有り難うございました。

400 :red:03/10/02 19:14
>398
使ってるよ

401 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/02 21:32
培養細胞へTransfectionしているもしくはいていた方いませんか??

402 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/02 21:35
401です。
していた方です。すいません。

403 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/02 21:51
RT: real-time
RT: reverse transcription

404 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/02 21:55
うちの部屋がついにRNA干渉(手技として)に手を出した

405 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/02 22:00
HEK293にリン酸カルシウム法でトランスフェクションしてますた。>>401

406 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/02 22:04
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407 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/03 12:16
400さん、real-time PCRを使うときにゲノムのコンタミの可能性を
どのようにして除去していますか?


408 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/03 16:47
>401
トランスフェクションされてましたが、何か?

409 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/03 22:11
>>407

400じゃないけど常識じゃん。
まずはRNAをDNaseIで処理するでしょ。
RTする時RT-のネガティブコントロールをやっておく。
後はPCRの時に同時にかけてネガコンでシグナルが出なければ
OKじゃん。まあone-stepでやる時はどうやるのか知らん。
だから俺はone-step嫌い。

410 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/03 22:40
>408
おたく、HEK?

411 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/03 22:54
E.coliにplasmidぶちこんで、蛋白をIPTG誘導しようと
してるんだけど、なんかうまくいかないなー

412 :E. coli:03/10/03 22:55
おまえに愛情が感じられん

413 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/03 23:36
つまらん
お前の話はつまらん


414 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 00:21
>>411
ありったけのIPTGをぶちこめ

415 :E. coli:03/10/04 01:28
そんなことしてみろ。
シャペロンいっぱいくっつけるぞ。

416 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 03:40
>>415
それだけは勘弁してくれ

417 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 10:42
http://www.jyouhou.ne.jp/j/index.cgi?anorio
メールでお送りするメールマガジンです。
情報の内容は「人生生活において、知っていると得をする情報」
すべてです。 その他、多くの一般人が知らないこと、
裏情報、裏技をノージャンルでお送りします。
(内容は懸賞の裏技,携帯電話iモード裏技など多種多様。
 伊東家の食卓の裏ワザと比べ物にならない高レベルです)

418 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 15:19
>>411
うちのプロトコールでは終濃度500mMだ。
いまのところ特に問題ない。

419 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 15:25
>>418
金持ちだなあ・・ 沈殿出ない? うち1mMでもリッチな気分なのに

420 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 15:34
ネタに決まってるだろ

421 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 16:02
ラクトースをfinal濃度2%入れて30分で収穫するならOK>IPTGの代わり

422 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 16:39
>>409
すいません あんまりよくわからないので詳しく教えてもらえないでしょうか?
RTの時のネガコンって何をどうするんでしょうか?

423 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 16:52
>>422
ゲノムの転写されていない部分のどこかターゲットにしてPCRかければいいでしょ?

シグナルが検出される→ゲノムが一定量以上コンタミしてる。問題になる。
シグナルが検出されない→ゲノムのコンタミが問題にならない。

もちろん、ゲノムDNA希釈系列で、ネガコン用のプライマーでシグナルが
でることを確認しておく必要もあり。


424 :409では無いですが:03/10/04 16:57
>422さん

>409にちゃんと書いてあるって
"RT-"="Reverse Transcriptase minus"ですよ。

2-stepならRT + or RT - でcDNAを合成してPCRへ持って行く
→RT-からバンドがでたらゲノムがコンタミしてるわな。

1-stepでも普通はReverse Transcriptaseはpremixに入ってないから
RT+/-どちらの反応系も準備できますよね。

っていうか何も考えてなさすぎじゃないか?
この程度のことはキットに付属のマニュアルに書いてあるぞ。
Real Time PCRの蛍光プライマーだって安くはないだろうに.....

425 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 17:03
>>424さん
ありがとうございます
確かに何も考えてませんでした
お金が飛びまくりでした

426 :名無しゲノムのクローンさん :03/10/04 17:12
RI以外でノザン解析するとき一番感度のいい検出試薬って何かわかりますか?
ちなみにいまはアマシャムのAlkPhos Directを使ってるのですが失敗しまくりです。

427 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 17:21
>426
失敗の原因がほんとに感度の問題なの?
いくら感度のいい検出系を持ってたとしても、ハイブリの温度やプローブのデザインが
至適化されてないと結局同じことなんではないのでしょうか?


428 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 17:43
>427
やっぱりそうなんですかね?先輩の実験引き継いでやってて、プローブも先輩が
使っててちゃんと先輩はバンドが出てたんですよ。でも僕は何回やっても失敗ばっか
で…

429 :手裏剣:03/10/04 17:58
このバンド?
http://www.muzie.co.jp/cgi-bin/artist.cgi?id=a016219

430 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 22:13
AlkPhos Directは簡便性重視で感度重視じゃないから、これで検出できるmRNAはかなりな高発現です。

431 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 22:39
>430
感度重視の検出法は御存知ですか?DIG法やってみようかと思ってるのですが。

432 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 22:45
>>419,420
あ、間違えた。
0.5mMだった。500μMね。

433 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 22:58
>431
いや、だからRIにしてもDIGにしてもAlkPhosにしてもプローブとmRNAの
ハイブリの条件等が変わるわけではないでしょ。
ハイブリしなきゃ検出感度云々の話にはならないんじゃないですか?
あと、サンプルRNAのクオリティなんかも先輩とはずいぶん違うんじゃないかなあ。
プローブのラベリングはホントに先輩と同じようにできてますか?

確認なんだけど先輩の実験系(同じターゲットmRNAで、プローブでAlkPhosで)
を引き継いでて、それを再現できてないんですよね?
なら先輩(卒業されてるのかな?)に一緒にあなたが再現できるまで実験してもらったら?




434 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 23:17
>433
ハイブリの条件というかハイブリに使う試薬はDIGとAlkで違っていたので。
それと先輩は卒業しちゃってるんです…。
それとtotalRNA使ってやってます。RNA抽出法もAGPC法、CTAB法とやってみた
んですけどね

435 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/04 23:57
>434

RNAの調整→泳動→トランスファー→プローブ調整→ハイブリダイズ
とステップを分けて検証してみたら?
ここで質問するときも、各ステップがどんな状況か書いてみたら
もっと具体的なアドバイスがあると思いますよ。
例えばRNA調整にしても方法だけではなく、泳動したときのバンドはちゃんと見えたかとかも。

私もそうだったんだけど、こういうのって上手い人と実験して教えてもらうのが一番なんですよね...
別の研究室でもいいからノザンやってる人は周りにいませんか?

436 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/05 00:04
>>411
一度、ペーパー読むことをオススメする。
というのは、蛋白によっては発現しない(あるいはしにくい)ものもある。
大腸菌によって有害なものであれば、発現するはずがないよね?
だから、入れている遺伝子に関するペーパー読んでみるのがいいと思う。

実際、漏れもBacillusの遺伝子を大腸菌に入れてやってるが、うまく発現してくれない。




437 :E. coli:03/10/05 00:28
有害なタンパク、発現させてみろ。
お前のケツから入って、増えまくって、ぶちまけてやる。

438 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/05 00:30
>435
そうですね。一応他の研究室の方にアドバイスとかはいただいてるんです。
RNAの調整をし、永動後のゲル写真でバンドは確認し、トランスファー後
再びゲル写真でバンドの転写を確認しました。
プローブはRT産物をPCRしてゲル抽したのを使ってるんですが、PCRで30
サイクルではバンドみられなくて40サイクルで増やしてます。
これってやっぱ目的のgeneの発現量が少ないってことなんですかね?


439 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/05 01:30

なんで発現系を換えないのか

440 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/05 08:39
AlkPhos DirectはプローブのDNAを直接アルカリホスファターゼでラベル
するもんだから、ハイブリは酵素が失活しないようなかなり特殊な条件だ
よね。手技の上で問題がないかどうかは、プローブに使っているDNAの希
釈系列を作って泳動し、それに対してSouthernをやってみるというのが良
いコントロールになると思うけど。DIG法は手順が多くて面倒だけど感度
は良いと思います。

441 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/06 00:17
>>436
コドンプラス使う
培地にグルコースを1−2%入れておく
培養温度を低くする
IPTG添加のタイミングをいろいろさがしてみる

この4点だけて、驚くほど発現量があがるケースが多い。
本当にトキシックな場合は、プラスミドが入っている
菌体だけが、まるでポジティブセレクションのように
コロニーとして生えてこないので、プレートをよく
観察するとわかる。そういうときには

プラスミドをamp以外の抗生物質耐性にのせかえて、
プレートも最小培地M9のプレートをつかうといいらしい

442 :E. coli:03/10/06 00:54
>441
おまえ、あんな株の言う事信じてるのか?>コドンプラス

>培養温度を低くする
>IPTG添加のタイミングをいろいろさがしてみる

愛情を感じる。。。ハアハア

443 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/06 07:47
>442
おまえこそ好き嫌いが激しいんだよ、このコドンは苦いだの酸っぱいだの
ロゼッタさんやプラスさんは俺たちのために好き嫌いを頑張って克服してくれたんだよ。
お前みたいな生意気な奴はいつか相手にされなくなるぜ!

444 :E. coli:03/10/06 17:34
あいつらだって、値段の割にたいした事ないらしいぜ。
余計な物ぶち込まれて、ヒーヒー言ってる状態だぞ。

オレをやさしく、いろんな条件で増やしてくれれば、
お望みのもの、増やしてやってもいいぜ。
オレが何ものかって?
BL〜だよ。
大事なのは愛だろ?オレだって生き物だぜ。


445 :ヘルプ!:03/10/07 00:18
酵母のプラスミドを精製しているのですが、protocolに2M ammonium acetateで、
-20℃で一時間インキュベートするとあります。
この過程はどうも、ゲノムDNAなどをのぞくためらしいですが、
一時間たつと凍ってしまいます。それを溶かして遠心しても何も沈殿しません。
なぜかたまたま凍らなかった場合は、遠心で沈殿ができ、精製もうまくいきます。
2M ammonium acetateが凍らないようにするにはどうしたらよいでしょう?

446 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/07 00:26
グリセリン

447 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/07 00:30
グリセロールを入れる

本当に「2 M ammonium acetate in an aqueous solution (or buffer)」と書いてあるか?

448 :445:03/10/07 00:31
グリセリンはやっぱ40%くらいになるようにしなきゃならないですか?
その場合、次の遠心などに影響はでませんか?
上記のように、凍る場合と凍らない場合があります。元々の塩濃度
なんかは関係あるでしょうか?

449 :445:03/10/07 00:34
>>447
Add 100uL supernatant to a fresh tube containing 100uL of 4M
ammonium acetate, incubate at -20℃ for 1h.
と書いてあります。この前のステップは、酵母を破砕しボイルするだけです。
8% sucrose,Tris, EDTA, tritonの組成の破砕液を用いています。

450 :445:03/10/07 00:35
あっもしかして、スクロースの微妙な濃度も関係しますか?

451 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/07 00:38
凍るのと凍らないのと差が出るのは
溶質の微妙な濃度、もしくは氷核の存否

452 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/07 00:39
ショ糖で差が出るなら
グリセロールやめて他の影響が出ない程度にショ糖加えておくといいよ

453 :445:03/10/07 00:51
諸先輩方アドバイスありがとうございます。
ショ糖を適当に加えてみます。

454 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/07 00:54
あまり「適当に」しないほうがいいよ
まずはショ糖で差が出ているのか検討
そうであったら、少しだけ増やす

455 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/08 18:25
発現ベクターとインサートをそれぞれEcoRIとXhoIで切断
→泳動→QIAGENゲル抽出→ligation→大腸菌へ
という作業をしたときにコロニーが全く出ないときが度々あります。
(コロニー出るときはしっかりインサート入ってます)

制限酵素処理後のベクターをアルカリホスファターゼ処理することがあると聞きましたが
やった方が良いのでしょうか?
恐らく初歩的なことでしょうから恐縮なのですが(既出かもしれませんが)よろしくお願いします。

456 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/08 21:03
>455
コロニー出たときは入ってるってんならそれはそれでいいんでないの?
コロニー出たのにスカばっかてのは困るけど。

コロニーが出たときの条件(切断の反応条件、フラグメントの精製度、フラグメントの量比、トラフォメの条件など)を
コンスタントに再現できるように努力すればよいのでは?
コロニーがでた時の効率をさらにあげたいというのであれば
AP処理(このケースでは有効なのかしらん)やら、いろいろ試してみればいいのでしょうけど。

出たり出なかったりって時は、本当に毎回(質的に)同じ作業をしてるかってのを見直すのも大事だと思うよ。

457 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/09 03:37
>>449
冷凍庫がー30℃とかってこともないよねぇ

>>455
紫外線の波長とかは大丈夫?

458 :455:03/10/09 10:35
ありがとうございます>456,457さん
コロニー出るときは入ってるのでこのままでも良いかと思うんですけど向上したいなと思いまして。
他の制限酵素の組み合わせのときは100個以上はコロニー出てほとんど入ってるのに対し
EcoRIとXhoIのときはなんとなく効率悪い傾向なので(一度Tベクターにインサート移し変えてから制限酵素処理してるので足場は十分)、
たまたま目にしたAP処理が有効かなと。
紫外線は312nmでぱっぱと切り出してるので問題ないと思います。

459 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/09 14:56
>458
私の場合
発現ベクターとインサートをそれぞれBamHIとXhoIで切断
→泳動→DEAE81抽出→ligation→大腸菌へ
という作業をしたときにコロニーが全く出ません。

おはずかしい限りです。digestionとDNAfragment濃度には問題ないと思われるので、
精製度を高めてリトライ中です。

460 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/09 20:38
2つの制限酵素サイトが近すぎてきちんと消化されてないんじゃないか?EcoRIとBamHIはまあ大丈夫だが、XhoIはすぐ隣のサイトが切れた後じゃほとんど切れないよ。

461 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/09 20:40
↑はベクターのマルチクローニングサイトのことです。

462 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/09 20:46
>455さん

>他の制限酵素の組み合わせのときは100個以上はコロニー出てほとんど入ってるのに対し
って私的には凄いなあ!って思いますよ。
私なんて100個以上コロニーでたら失敗した〜って(ベクター切れてなかった?)思ってしまう......
それだけの技術があって、EcoRIとXhoIの組み合わせのときだけおかしいというのであれば
それは455さんの腕ではなく、ベクターや酵素に問題があるのでは?とおもってしまうのですが......

463 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 03:39
XhoIってKバッファの方が切れやすいからシングルではよく使うけど
ダブルだとHを使うかなぁ。確かに1〜2時間だと酵素けちると
切れが悪い。

ちなみにエタチンしないと失活しないみたいだし。

464 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 11:06
そもそもXhoIってライゲーション効率悪いんじゃなかったっけ?
宝のマニュアルにもあるくらいだし。わざわざ難しいのを使わないで
EcoRIとかBamHIとかHindIIIとかXbaIとかでやればいいんじゃないかなぁ。
エタ沈で失活云々は泳動かましてるからまあ問題なさそうですね。

465 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 11:48
なるほど>464さん
個人的にはAP処理の是非をお尋ねしたいです、みなさん
私もベクターだけAP処理してる文献をいくつか見ました
でもリン酸化・脱リン酸化…よくわからなかりませんでした…
455さんによるとしなくても酵素の組み合わせ次第では無理矢理いけそうですが。

466 :459:03/10/10 12:47
ちなみにみなさんLigaseはどのメーカーのものを使っていますか??
今日知ったのですが、Japan遺伝子のT4DNAligaseよりも宝のLigation kit ver2の
ほうがいいらしいですな。

467 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 13:58
real-time PCRを使っているものですが、cDNA合成時にゲノムのコンタミをなくすためには
mRNAを精製するかDNaseを用いるかで迷っています
使っている方でどなたかアドバイスをお願いします

468 :459:03/10/10 16:34
ベクターをBamHI,XhoI,BamHI・XhoIダブルで消化し、
このサンプルをいきなり大腸菌に形質転換したところ、全く生えてきません。
このサンプルをセルフライゲーションしたところ、BamHIでは生えてきましたが、XhoI、ダブルは生えてきませんでした。
以上のことから、
@XhoIのライゲーションがうまく行ってない
Aそもそものサンプルに園が残り過ぎている
等の可能性が考えられます。

469 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 16:51
>468
> ベクターをBamHI,XhoI,BamHI・XhoIダブルで消化し、
> このサンプルをいきなり大腸菌に形質転換したところ、全く生えてきません。
「このサンプルで大腸菌を形質転換する」が正しい。
あとセルフでいくつコロニーが出たか知りたいところだわな。

470 :469:03/10/10 16:55
ついでに漏れは宝のver.1つかってる。
ベクターとインサートまぜてエタ珍してからバッファー加えてる。
そのほうがサンプルもキットもケチケチ使える。

471 :459:03/10/10 17:00
セルフで24コロニーですた。

472 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 17:06
>471
それじゃdouble digestionしてインサートつっこむのは無理ぽ。
ライゲーション効率もしくは形質転換効率が悪いと思われ。

473 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 21:13
リン酸カルシウムによるtransfectionについての質問です。
いままで、自前で作ったLTRを持ったベクターをウイルス産生前に
確認のために293(無印)やNIH3T3にtransfectionしたのですが、
全く導入できません。同じ試薬で違うセルライン・プラスミドでは
導入できていたのですが。ベクターがおかしい以外の原因として、
導入細胞が悪いのか、試薬が悪いのかがあると思いますが、
ここで、質問は、1)やたらに継代した細胞はこういった導入効率が悪くなる
ことがあるのか??2)使う試薬の2xHBSのpHは、6.95-7.10の範囲を超える事が、細胞によってあるのかです。
すみませんが、何かご指南頂ければと。

474 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 21:58
>>467
イントロンをはさむようにプライマーを設計して、
ゲノムが増えないようにしてみるのはどうです?

475 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 22:09
>>467
DNaseを使うのが遥かに簡単。
mRNAを精製するのもいいけど、kitあるならいいけど。そうでなかったら
面倒だし、kit使っても微量になるからRNAの扱いが難しくなる。

>>474
の案もいいけど、以外とintron lessの遺伝子ってあるもんだ。

だから俺はDNaseがお勧め。買う時はできるだけ濃いのを買うこと。

476 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 22:19
>>464
XhoIはライゲーション効率悪くないよ。まあ数値的にはどうか
分からないが、サブクローニングできないほどは悪くない。

477 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 22:22
あと、エタノールprecipitationで酵素が失活するって嘘だからな。
そんなの信じるなよ。きちんとphenol使って失活させないと駄目。
もしくはgelで精製するか。

478 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 22:35
>477
確かに。
漏れはエビのアルカリフォスファターゼのときも加熱よりフェノクロ。
ライゲーションのときに残ってるのを想像したら・・・

479 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/10 22:36
CIPは65度15分でだいたい失活しないか?
BAPはフェノクロ必須だが。

480 :477:03/10/10 22:57
あ、酵素の失活って制限酵素のことね。言葉足らなくてすまん。

それと、>>455の場合APは関係ないな。結論はしなくてもよい。になる。
だいたいダブルダイジェストの時にAPしなくてはいけない場合って
片方の酵素であまり切れてないからそのセルフdigestionを防ぐために
やるのであって、コロニーが全くでないのはそれとは関係
無いからさ。

それなのに、ここでのsuggestionは的外れなものばっかりで正直がっかり
してるよ。まあ、中にはまともなのがあったけど。

481 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/11 13:12
↑ エラソーにしているところ申しわけないが
×セルフdigestion → ○セルフligation

482 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/11 18:18
>>480
そうなんだ、PvuIIだと確かに残るけど、XhoIは
エタチンでは駄目ですか。タカラのマニュアルでは
いいって書いてあるけど。

483 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/11 18:22
>>471
大腸菌の効率はどのくらい?1ngの切らないプラスミドで10e4くらい
出ないと実験やりにくくない?

484 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/12 16:03
1ugあたり10の7乗ー8乗が基本でしょ。
生物物理に書いてあった方法でつくればDH5aはコンスタントに
それくらいはいるようにできるよ!

485 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/12 20:51
http://www.itshappening.com/upload/chechclear.asf
とりあえず家にもって帰って実験します。

486 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 00:33
>>484
「生物物理に書いてあった方法」ってなんだぁ?
そんなのお前にしかわかんねぇだろぉが。
あんた研究者むいてないよ。


487 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 00:46
研究者に向いていないというか、生物物理って生理学でしょ。
生理学の本で手技にちょこっと書いてあるのより、分生の読み物が出てこないのはなんでだろう。


488 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 02:42
ちがうって。
「生物物理」の機関紙に、東洋紡の人がコンピーテントセルの
作り方を書いた日本語プロトコルがあって、うちのラボでは
それが出回っている。コンピテントセル作成法としては
かなり最強に近いプロトコルらしいが。
>>486 他人をけなす前にgoogleで検索してみそ。

489 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 02:53
ちなみにTOYOBOのcompetent highを作成するのに使われたものの
prototypeらすぃ。同じネタが羊土社のテキストとかに再掲された
ので、そちらを使ってる人もいるかもしれない。

なおネットで検索したら一発で
http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/bnsikato/protocol/a11.html
にぶち当たった。まあこのとおりにつくりたまえ。

490 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 05:11
>>489
何かと思ったらInoue Ultracompetent法ですか。

いつも使い終わったTBにブリーチ入れてそこら中を真っ黒にしてしまうのは秘密です。
pLysSが入った菌のコンピをこの方法で作ってほとんど菌が生えてこなかったのも秘密です。

491 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 05:16
いのうえってだれ?

492 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 09:55
pLysS入りでもウチじゃこの方法で問題なく作ってるけど

493 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 15:04
コ ン ピ は 買 う

494 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 15:25
コンピテントセルを作る?
スクラッチ(採菌)から?

495 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 15:56
>>491
東洋紡敦賀バイオ研究所の井上浩明主席

496 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 18:35
http://www.itshappening.com/upload/chechclear.asf
すごい実験だ。


497 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 23:27
Strataのsubcloning gradeなら買っても1本600円だよ
労働力の少ないラボなら買った方が効率いいよ

498 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/13 23:32
>>495
偉人だと思う。

499 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/14 00:58
>>496
うっかり見ちまった。
今夜眠れるか心配だな。

500 :500:03/10/14 07:00







501 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/14 07:03
作ったら1回100本くらいできるよ
資金力のないラボなら作った方がいいよ

502 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/14 14:02
RT前のDNase処理はどれくらい酵素を入れてるんでしょうか・・・?
10Uだと全然ゲノムが分解されませんでした
50Uとか100Uぐらいいれてもいいんでしょうか?
よろしくお願いします

503 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/14 14:06
>502
どかっと使ってる。
でも、DNaseは失活してないか?

それとバイオラッドのゲルろ過スピンカラムって
使ってる人いますか?

504 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/14 16:02
incubationってなんですか?

505 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/14 20:06
>502
どれぐらいの反応系に10U入れてるかは分かりませんが、
必要以上に多くのサンプル量を処理しようとしてませんか?
PromegaのHPによるとゲノム1 microgramに対して1unitを加えろとあります。
10Uで処理しきれないとなるとゲノムDNAは10 microgram以上、
RNAはゲノムに対してどれくらいの量とれるんだっけ?(ここはよくわからないので調べてください)
またRT-PCRの反応系に加えるRNAテンプレート量は多ければいいってものでもないです。
それならばテンプレート量を1/10にして、サイクル数を4サイクルくらい増やした方がいいでしょう。
その方がノンスペシフィックな増幅も押さえられると思います。

506 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/14 20:57
>>504
卵を温めること
インキュベータは卵を温めるもの・人・機械(孵卵器)
大腸菌などをインキュベータで37℃などに温め、大腸菌の卵を孵化させる


507 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/14 22:03
>>497
subclonin gradeで良いならホンの片手間で出来るだろ。そんなもんに金払うなんて、わざわざ無駄遣いするためとしか思えんぞ。月に一度くらいしかtransformationしないとか言うなら別だけど、普通に使うならその金でバイトでも雇った方が何ぼかマシだ。

508 :497:03/10/15 01:05
>>507
環境によるね
うちは極端に労働力が少ない。
助手が主力労働者で、そんなことに時間使ってられない。
以前にいた労働力大量ラボではM1が作っていたが、
状況が違いすぎる。

バイト雇うには月5,6万はかかる。
しかも、1年以上は雇わないと。
年間60万。
教える手間もかかる。
60万あれば、Competent cell 1000本買えます。

うちでは分子生物の実験するのは助手2人くらいで、
遺伝子と離れる期間も多い。
消費量が少なく、買うのが効率的と判断しました。
極貧になったら作るつもりです。

509 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/15 09:59
あんたの議論はおかしいぞ! コンピ作る程度のバイトなら1ヶ月単位から雇えるよ。さらに60万出して1年雇うなら、他の仕事だってさせられるだろ。
そもそもsubcloning gradeのコンピなら、片手間仕事(実労2時間)で出来る。それで200本は出来るから時給6万だ。あんたの時給がそれ以上なら買いな。

510 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/15 15:38
His 融合蛋白(75kD) を BL21 につくらせたいんだが、
 可溶画分に全然入ってくれません。
 IPTG 0.1mM, 30℃で誘導かけてるんですが。
 他の研究室ではBL21-SI という細胞をつかってつくらせたところ
 少量はとれたようですが、BL21-SIはもう発売中止なんです。

 不溶画分で封入体に入ったやつを尿素とかで変性させてとりだすと、
 やっぱ酵素活性とかは期待できないですよね。

 あと、amersham のHis カラムをつかってるんですが、いくら
 洗ってもきょうざつ物がべっちりついてきてしまいます。
 His の場合はしょうがないんでしょうか?

511 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/15 15:55
>510
1.BL21-SIを持ってる研究室から分けてもらう
2.リークして発現してるのがまずいのかもしれないのでリークを抑える方法を使う
3.とりあえずUrea変性→巻き戻しする (75kDaではあまりお勧めできない)
4.最近たくさん改良型大腸菌株がでてるので,かたっぱしから試す
5.Hisタグやめて別のタグにする
6.誘導後の温度を下げる

くらいかなぁ・・・
キレーティングカラムはあまり使いまわさないで捨ててる。
使いまわすなら塩酸グアニジンとEDTAで洗ってニッケルキレートしなおす。

512 :511:03/10/15 15:58
追加するが,
この手の質問なら「タンパク質の精製2」スレが良スレ。

513 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/15 16:02
>511

リークを抑える方法ってどんなのがあるんですか?

514 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/15 16:06
>>513 とりあえず、このすれ眺めてみそ

大腸菌について極めるスレ
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1020772225/l50

515 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/15 20:42
>510
カラムはHiTrapHisカラムですか?
ウチでもBL21 Background のExtracctを流してマニュアル通りのBuffer使ってるけど
最後にきれいに洗えてるけどなあ。

Ureaで変成させても透析なんかでRefoldingさせれば酵素活性を回復させられるものもある。
Refolding法についてはシクロアミロースとやらを使った方法も最近は注目されてるみたい。
上手くいくかはこればっかりはやってみないと分からない。

516 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/15 21:52
つーか30度ってのがまだ高すぎるでしょ。
16-25度位まで試してみれば?まあ16度以下でもいいけど。
あと誘導時間はどれ位なのかな?

517 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/16 21:28
ここでアドバイスを受けたひとー、出来ればその後の結果をフィードバックしてくれまいか?
ココで出てきたアドバイスが有効だったのかはフィードバックがないと分からんのよ。
アドバイスした側も成功にたいして100%確信があるわけではないので
ソレがだめだったという報告も貴重な情報なのよね。



518 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 01:03
>>516
pGEXならともかくpET系で25度以下というのはお勧めでkません。
T7-RNApolの至的温度の幅が結構シビアで、25℃以下ではRNAほ
とんどつくりません。

519 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 02:34
レンチウィルスのベクター使った人いる?
既存のレトロと比べてどんなものでしょう?


520 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 12:35
今、リン酸Ca法でtransfectionやっているのですが、
POSコンのGFPベクターは導入確認できたのですが、
肝心のベクターで全く導入できていませんでした。
抜きのIRES-GFPを挿入したレトロベクターです。で、
幾つかトラブルの原因として、
1)コンストラクトするときに、決定的な何かを忘れているのでしょうか??それか余計な何か配列を加えてしまっている??ちなみに、
BDのIRES-GFPベクターをMCSからPolyA配列手前までPCRでクローニング後に、ベクターに挿入しています。
2)リン酸カルシウム法の何かがおかしい。このレトロベクターにPhを再調整する必要があるにあるのか?POSコンは成功しているが。
3)DNAに不純物等が多い。
等があると思います。この中でも1)に関して何か、教えていただける
とありがたいです。宜しくお願いします。

521 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 15:26
抜きのIRES-GFP-×
PolyA配列抜きのIRES-GFP-○

522 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 17:20
>312
植物系だけどCTABを50MLチューブぐらいのスケールでしてます
フェノクロは動物系って印象があります

523 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 22:40
>>520
「全く導入できない」という根拠は何ですか?
それによって考えられることが違うのではと。


524 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 23:09
>>522
植物でもウチはフェノクロでしてるYO.
サンプルが花弁組織だからタンパク・多糖がかなり多いんだべ.
取ってるのはRNAだけどね.

でも葉はCTABでやるですな.
スケールはやはり50mlチューブか15mlチューブで.

525 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/17 23:23
>520
ようするに定番のGFP発現ベクターと、自作したGFP発現プラスミドをトランスフェクションした時に
前者はGFPの蛍光が観察されるのに、後者は観察されないってこと?
翌日に蛍光を観察するなどしてのtransientな発現を見てるんであって、Stableじゃないですよね?
どちらのプラスミドも同様のプロトコルで調整してるんなら、そもそも自作プラスミドに問題があるのでは?
ケースバイケースなんだろうけどpolyAを抜いたら発現レベルが低下すると考えるのが普通では?
フラグメントを挿入したベクターがなんなのかは分かりませんが、polyA の欠損を補うシグナルは入ってるの?
こんなこと聞くのもなんですが動物細胞での発現用のベクターなんですよね?

526 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/18 20:03
520です。
525さんの言われるとおりです。
ベクターがLTRのあるレトロウイルスベクターなので、polyA抜いてます。
やっぱり自作がおかしいんでしょうね。一応、デザインとして
プロモータ:5’LTR-MCS-IRES-GFP−STOP CODON-3’LTR
としてます。

527 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/19 01:24
>526そのベクターの設計で大丈夫だと思います。信用のおけるウイルスヴェクターに自分でMCSとIRESーGFPを入れたんですよね。
トランスフェクトに用いたDNAは組み換えを起こしていないこと確かめましたか?コンストラクトしてマップで確認し、さあできたと思いラージスケールで作ったら、たまたま組み替えの起きたクローンをひろったか、短くなってしまったことがあったので

528 :497:03/10/19 01:27
>509
だから、環境によるよ。
あんたの時給って日本の場合は研究室の予算じゃないでしょ。

バイトはうちの場合は委任経理だけど、短期は事務の方針でだめ。
長期になった場合、委任経理で年間60万は厳しいです。

消耗品なら、面倒見てる他講座に買ってもらうとかできるから、
買いやすいのですよ。

529 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/19 01:29
527ですが
>526をもう一度見直して
Promoter;5’LTRというのは別のプロモーターフラグメントを5’LTRのまえにいれたのですか?
別のプロモーターでドライブするなら
5’LTR−Promoter-MCS−IRES−GFP-LTRでなくてはなりません。
書き違えかも知れませんが、ねんのため。

530 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/19 01:37
>>520
コントロールのウイルスベクターを感染させることができるんだから
感染の手法はあってるってことだよね。
527のいうとおり、自作のベクターが組み換えを起こしてるか、根本的に
構造がおかしいかのどちらかだと思われる。
一度、そのプラスミドをパッケージング細胞にトランスフェクションした
時にパッケージング細胞がGFPで光るかどうかFACSかなにかで確かめて
見るといいよ。そこで光っていなければ自分で作ったプラスミドに問題が
あるということだろうね。

531 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/19 01:48
527ですが、さらに付け加えを。
プロモーターに用いるフラグメントはスプライスサイトの含まれないminimizedなものである必要があります。インサートのほかの部分も同様です。
また、一般にレトロにいれられるインサートは合計で7−8kb程度です。かさねて、念のため。
問題は

532 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/19 10:31
>>519
レンチは作るのがすごくめんどくさそうだよ。
トランスフェクションしまくって大量に上清集めて超遠心して濃縮してる。
うちはレンチウイルスに(ほぼ)専属のテクがいまつ。

533 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/19 15:44
520です。
プロモータ:5’LTRとは、プロモ-タとしてLTRを使ったという意味で
書いてしまいました。わかりにくくなってすみません。
後、インサートは1.5kbです。stop codon〜3'LTRまで100bp
程余分な配列があります。

534 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/19 16:09
>>528
いや、時給云々ってのは、2chに書き込みしてる暇があるならその時間で自分で作ったらどうかってことなんだけど…

535 :497:03/10/19 21:46
>>534
それを言われると言い返せませんですな(笑)
これと同時にやってるウイルスの議論の方が
はるかに実りありそうだし

う〜ん、次はコンピ作ろっかな〜


536 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/20 11:33
527です。そのコンストラクトで間違いのないと思いますが。LTRだけでIRES−AP(あるふぉす)を動かすものを使ったことありますし。
僕がやるなら
1.ウイルスを別のソースからもらい再コンストラクト
2.stopから下流の余計な配列は念のため取り除く(認識していないスプライスサイトなど転写に影響するものが入っていたら困るので)。
3.発現の程度が問題とならないのなら、強いプロモーターを入れてそれでドライブ。

ですか。ウイルスベクターはコンストラクト最中に組み換えを起こすことが多いので、どうしても信頼の置けるソースのものを使い、自分で複製する際も気をつけないといけません。
また、付け加えですが、これまで作られてきたパッケージングセルラインも変質しやすいものが多いです。
アドバイスになりませんね。

537 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/20 19:19
DNAのゲル抽がうまくいきません。今10回くらい連続で失敗してます。
QIAquickっていうKIT使ってます。泳動して、エチブロ漬けて、バンド
の切り出しまではうまくいってると思うのですが…。後は付属のプロト
コールに従って操作しています。アドバイスお願いします。

538 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/20 19:36
「うまくいかなかった」のはどうしてわかりましたか?

539 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/20 20:18
最後に吸光度計で測ったらDNA濃度がマイナスになってしまいます。
100分の1希釈で測ってますが、10分の1希釈ではたまにプラスで出ます。

540 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/20 20:46
ゲルで流してみたら?


541 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/20 22:16
あのさ、例えば1μgのプラスミドからその1/10のサイズのバンドを切り出して、それを20μlに溶出したとしてさ、収率が50%なら2.5ng/μlなわけよ。それを1/100に希釈したら25pg/lになるだろ。その濃度で、OD260は小数点以下何桁目に引っかかってくるかって考えてみなよ。

542 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/20 23:23
私は松田修二というひとをさがしています。もし、もしご存知でしたら、情報を提供してください。

543 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/20 23:45
ゲル抽物を吸光度で計るってのは初めて聞いたな。
独り言だがゲル抽はキット使わないほうが好きだな。

544 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/21 00:23
うちのラボではWizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up SystemというDNA抽出キット使ってます。
吸光度も測定しますが、20倍希釈で測定してます。

545 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/21 01:19
吸光度がマイナスになるのは、ブランクとサンプルを取り違える時
くらいかな。

546 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/21 13:43
537ですがゲル抽産物の収量はどのくらいなのでしょうか?
僕の場合最低10ng/μlは欲しいのですが足りません。
ゲルの濃度や厚さも関係してるのでしょうか?ゲルは薄いほうがいいと
聞いたのですが。

547 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/21 21:57
あのさ、>>541読んできいてんの? たいがいの方法なら
収率90〜50%ってところだろ。ゲルの厚さや濃度が多少
変わっても、収率50%以下にはまずならない。で、収率
50%と仮定して、プラスミドが5kbで切り出すフラグメ
ントが1kbなら、10ng/μlで25μl欲しいなら、プラスミ
ドを2.5μg消化する必要がある。切り出すフラグメント
が0.5kbなら5μgだ。それだけのプラスミドからスター
トしとるのかと小一時間…

548 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/22 03:20
ゲルが薄い方がよいというのは目的の断片だけをちゃんと切り出せということ


549 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/22 03:29
数μgからスタートすると
ゲルに無造作に流すとスタックして原点側に禿しく尾を引く

収量が悪くなる原因の1つだ

MUPIDの場合にはコームの狭い方の2レーン分を
絶縁用ビニールテープでつぶして大きなウェルを作り
サンプルを50〜100μLに膨らませて入れる
(ゲルの断面を広く使う)

泳動は50vで
ゲルは氷で冷やしてゆっくりすること



550 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/22 09:29
切り出し用幅広コームも売ってるよ

551 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/22 11:10
>>537
アクリルアミドゲルだから

552 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/22 12:52
今Cx43の免疫染色で行き詰っています。
パラフィン包埋組織、凍結組織を使っています。
一次抗体はZymedのCx43を使用しています。
しかしどうしても染めることができません。
どなたか良い条件を教えてもらえなすか?

553 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/22 16:09
>552
10mMNaCitrate中で組織を電子レンジボイルしてから染めたら?これは多くの場合(特に核淡白)、いい結果出るよ。
細胞質の蛋白のなかではGFPもさらによく染まるようになると思う。ところでCx43ってなに?Connexin?

554 :552:03/10/22 18:52
>>553
ご回答有難うございます。
CxはConnexinのことです。
できれば電子レンジの時間などの詳細を教えてもらえませんか?




555 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/22 22:32
で、>>537は全長何kbのプラスミドを何μg泳動して、何kbのフラグメントを抽出しようとしてるんだ?

556 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/23 09:46
>552
ttp://public.bcm.tmc.edu/rosenlab/protocols/generalIHC.pdf
にはantigen retrievalの方法が3種類でてるよ。いずれも蛋白のconformationをかえたり、溶解して
抗体の抗体認識部位へのアクセスを高めるのでしょう。ただ僕は10分くらいしかチンしてないけど。結果出たら教えてね。

557 :552:03/10/23 14:45
>>556
どうも親切に有難うございます!
結果がでたらまた伝えます。

558 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/23 22:03
PCRでCy3-dUTPを取り込ませて標識したいのですが、どうしても取り込んでくれません。
増幅はするのですが、泳動すると普通のdNTPを使ったものと同じ位置に出ます。
酵素はExTaqとPfuを試しました。どなたか助けてくださいませ


559 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/23 22:14
>558
exo活性のないTaq使ったら?

560 :558:03/10/23 22:24
>559
そうですよね・・・ 
ただ先輩がそのプロトコルで増やしていたもので・・・
増えないわけがないといわれ・・
普通のTaqで試してみますね

561 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/23 22:36
先輩のプロトコルは疑う,これ鉄則

562 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/23 22:54
ん?
558に関して質問。
Cy3-dUTP標識PCRサンプルって泳動でデカくなるの?
Cy3って比較的小さいし、単純に考えても1/4塩基にしかラベルされないし・・・

563 :558:03/10/23 23:04
>562
なると思っているのですが・・
末端Cy3標識のプライマーで同じものをPCRかけると、
10bpぐらい泳動が遅れてます。


564 :558:03/10/23 23:10
PCR産物は100bpちょっとで短いのです。

565 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/24 05:02
モマイラ分子量が大きくなったら必ず泳動は遅くなると考えてるのか?
Cy3とアームの帯電の影響を考慮しる


566 :562 :03/10/24 09:16
でも実際、末端では遅くなるって言ってるし・・・
末端と中では影響が違う?
俺はマイクロアレイ用cDNAなどを標識してるけど、単一PCR産物は無い。
ま、泳動サイズよりも蛍光で見るほうが感度いいし、一般的と思うけど。

567 :558:03/10/24 15:42
朝まで試行錯誤しましたがExo活性ないTaqでも変わりませんでした。
今日は気まずいプログレでした・・
>562
僕もマイクロアレイです。ハイブリしてもシグナルはありません。
蛍光でみるっていうのは、吸光度ですか?

568 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/24 16:40
>567
というか,先輩はどうやって検出してるんだ?

569 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/24 16:45
 初心者な質問ですみません。
BL21でコンピテントセルを作りたいのですが、
ODがどれくらいになるまで培養すればいいのでしょうか?

570 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/24 18:02
0.4


571 :562:03/10/25 03:09
>567
マイクロアレイなのにPCRなの?
ちょっと理解できないけど、特殊な系かな?
蛍光検出は
1)泳動後、蛍光検出(長さが分かる)
2)OD550測定で定量
例えば・・・
 ttp://www.clontech.co.jp/manuals/pdf/PT3452-1-J.pdf

572 :名無しゲノムのクローンさん :03/10/25 10:35
ligationして、そのplasmidでE.coliをTFして、
mini-prepすると妙に短いbandとか出てこない?
8kb(vector)+4kb(insert)=12kb
なので8kbか12kbか、あとは有りえても16kb(8kb+4kb*2)とかなのに
、3kbとかのがでる。実験に支障ない事多いけど気になって仕方ない。

573 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/25 15:52
ヴァカ?


574 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/25 16:07
はげ

575 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/25 16:29
star活性ぢゃないか?

576 :田中 次郎:03/10/25 17:49
blunt end ligationのコツを教えてください。タカラのblunting kit
使用しています。両端EcoRVで切り出した2kbのインサートを4.5kの
vectorのEcoR1 siteに入れたいのです。vector:1μg,insert:2μg
ではじめ、insertの切り出し後の泳動チェックやフェノクロ、エタ沈
し、vectorのEcoR1 cut後フェノクロ、エタ沈し
bluntingはkitの説明書とおりにやり、フェノクロ、
エタ沈もやりvectorの量を泳動チェックし、
ligationはタカラadenovirus kitに付属している
ligation solution:10μl、insert+vector水溶液10μlで1時間
処理しフェノクロ、エタ沈し、self ligation抑制のため再びEcoR1 cutし、
フェノクロ、エタ沈し、total:6μlの水で
溶かし、内4μlでchemical competent cell にtransfectionしましたが
得たコロニー数6個すべて空vectorでした。

577 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/25 17:51
人気シリーズの登場ですが今回は高校を卒業したばかりの19才、予備校生です。
ペニスを抱え込みながらの嬉しそうな笑顔が妙にスケベでいいアングルです。

http://www.traffimagic.com/WIPEDMMSNCA/B000731/comein/FSJPN?count=-1

578 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/25 19:32
>>576
むむむ、インサートはEcoRIで切れないよね。
俺ならライゲーション一晩まで試す

おっとその前にベクターの脱リン酸化は?

579 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/25 19:53
>>576
vectorのEcoR1 cut後ゲルで切り出し精製

もしくは

InvitorogenのTOPO使用

580 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/25 23:25
つーかさ、サブクローニングでうまくいかなくてごたごたいう人
多いけど、あれってコントロールをきちんととればどのステップに
原因があるかはっきりわかる実験なのね。
だからどうかきっちりコントロールとってその上で質問してほしい。

当たり前の話だろ?それがわからなかったら実験やめたら?

581 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/27 19:24
>567
 泳動でサイズの変化、吸光度で定量と標識率計算してます

>562
ありがとうございます!
今は発現解析ではなく、SNPのタイピングに取り組んでいます。
ゲノムからPCRして、アレイで検出です。

582 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/27 19:29
>>580 俺もそー思う。滅茶苦茶にコントロールとればいつかはできるって。
人生終わるかもしれないけどね。ひひひ。

583 :あまりにも人に認めてもらいたくてくるいそうな人:03/10/27 19:57
無限個のコントロール、ああなんていう美しい響きなんだ。。。。

584 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 21:21
エタノール(99.5%)149mlと水51mlを合わせても200mlにならない(少し少なくなる)から
75%エタノールは大型ピペッタ使わずにメスシリンダで調製してるんだが
滅菌どうしてる?75%エタノールに菌なんかいないだろ、という指摘はさておいて
うちではフィルタ滅菌してるんだけど。。。
同様に100%(=99.5%)エタノールもフィルタ滅菌してる。
ガラスのピペットやメスシリンダは熱でわずかに歪むから
オートクレーブも乾熱滅菌も禁止なんだ。
100%エタノールでも試薬瓶からファルコン管にまさか直に注ぐわけにいかないし。

585 :実験で困っている人:03/10/28 21:49
EcoR1 cutがうまくいきません。どうすればいいですか?

586 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:12
>>585
何をやって、うまくいかないんだ?

587 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:25
DNAを切ろうとしてです。お願いします。

588 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:27
>584
ネタ?

589 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:29
>>587
いや、もっと詳細を。
どういう風にして精製したDNAか?
反応条件は?DNAの濃度、それに対して入れた酵素の量。

最低これくらいは情報がないと。
あなた4年生?ならし方ないけど。

590 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:29
>584
なぜ滅菌する必要がある。うちでは全然してないよ。
>585
DNAはきれいなのか?

591 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:29
>585
まず自分でEcoRIを精製汁!

592 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:31
>584
ガンマ線照射

593 :名無しゲノムのクローンさん :03/10/28 22:45
gel shift assay経験者様
non-specificなbindingを防ぐpoly(dI-dC)は自分で設計したoligo使ってるの?
教えて。
楔(くさび)役の学生は手探り状態で何もかもやらにゃあかんから疲れます。。。

594 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:48
>>593
ファルマシアで売ってない?昔は売っていたよ。
つーか設計も何もないと思うよ。

595 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:48
>585
EcoRIでなくてEcoR1を使ってるのか?
あー、それじゃ駄目だなあ、それは某国製のバチモンだよ。
もしかして腕にはC-SHOCKはめてないか?

596 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:49
DNAはフェノール:クロロフォーム抽出法とエチルアルコール沈殿法で精製しました。
分光光度計法で濃度と純度を算出したのち制限酵素の取扱説明書にあるとおりに希釈し
制限酵素の取扱説明書にある濃度で量を加え
制限酵素の取扱説明書にある条件で保温しました。

597 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:49
>593
ttp://www4.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/content/Products?OpenDocument&parentid=41313&moduleid=41316

598 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:50
>596
で,EcoRIサイトはあるのか?w

599 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:51
*RNA*の制限酵素を一番多く取り扱ってる会社はどこ?

600 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:52
これからシーケンシングする予定ですのでそれはわかりません。

601 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:54
>600
cutが目的じゃなくてマッピングね?

602 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:55
制限酵素を切る目的以外に使うことなんてあるのですか

603 :593:03/10/28 22:56
>594様
>597様
レス早くて少しsurprisingな状態。
ありがとね。
2chも捨てたもんじゃないね。

604 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:57
>>602
君はEcoRIで切れないと最初に質問した人かい?
忠告だけど、ここで聞かないで自分で解決したほうがいい。
これくらい解決できないはずないでしょ。
それが自分のためだよ。

605 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:59
>602
売る,結晶化する,BSAの代わりに使う

606 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 22:59
済みませんが601に対する疑問602にお答えください。

607 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 23:01
ウシ血清アルブミンを大量に買ってる部屋はブロットのブロック以外に「一般的」に何に使うのですか。

608 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 23:01
>607
その部屋はどこにあるのですか?

609 :601:03/10/28 23:07
>606
まぁ書き方も変だったわけだが・・・
とにかく藻前の質問には突っ込みどころが多すぎる.
よってreject。

610 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 23:10
>>607
いろんなことに使う。一言では言えない。
特に必要なかったら知らなくても困らないでしょ。

611 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 23:15
いや、だから知りたいのはブロッティングのブロッキング以外の「一般的」な使途です。
いろんなことはいいです。一般的な使い途を。

612 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 23:39
>>584 あまりに突っ込み所満載なので念のために聞きたいのだが、これはEtOH沈殿の後のリンスに使うためのものかい?

613 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 23:44
「一般的」にいろんな用途に使う

614 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/28 23:46
じゃ例をいくつか挙げてくださいませんか?

615 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 00:32
BSA, 蛋白定量のスタンダードに使うぞい


616 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 00:50
ELISAのブロッキングにも使うぞい
ゲルろ過のキャリブレーションにも

617 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 01:11
ELISAのブロッキングにも使うぞい
ゲルろ過のキャリブレーションにも

618 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 13:56
酵素反応の安定化剤>BSA

619 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 14:18
Tm値の実測ってどのような方法があるのでしょうか?
リアルタイムPCRによる融解曲線とかは思いつくのですが・・
吸光度によるものも聞いた気がします
どなたか教えてください

620 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 14:37
●●●マスコミの「盗聴、盗撮」は許されるのか?その8●●●
http://natto.2ch.net/mass/kako/1011/10115/1011522150.html
290 名前: 投稿日: 02/02/14 11:38 ID:6fbKGLCS
>>266
大衆週刊誌(文春とか新潮とかポストとか)の漫画家も盗聴を使っているね。俺
が思いついたネタを使っていた漫画家を偶然見つけたことがある。そいつはテレ
ビで生意気なことをしゃべっているよ。盗聴がばれているのに、哀れだ。
ただし、漫画家家本人が盗聴を使っているのか、雑誌社が盗聴を代行している
のかは、わからない。俺は雑誌社だと見ているのだが。

240 名前: 213 投稿日: 02/02/10 15:36 ID:jE2ivfkk
一般人で「お部屋拝見」で見せている人も、実は陰で裏切られている
(盗聴されている)んだと思うと、可哀相だなと思う。
芸能界に入りたいと思った事は無いが、
マスコミや華やかさに憧れるのは、別にその人の勝手だし、有名になるのが好きな人は、
その人なりの夢なんだろう。その夢まで何か言おうとは思わない。
でも、そういう人だからといって、盗聴されたり、嫌がらせを受けていいわけではない。

84 名前: ○○○ 投稿日: 02/01/31 01:15 ID:l3fSW81R
>>78
たぶん、君が書いている通りだよ。確信犯だ。テレ朝が、俺の電話を盗聴
したネタを使っているのは、ずいぶん前から確認している。俺だって、メディアに
ネタを提供するために生きて行くつもりはない。ついでに書くが、フジの「恋のちから」
をチラッと見たが、盗聴からヒントを得ている。盗聴は盗聴。いいかげんにしろ。

621 :切実に困っています:03/10/29 15:58
BamH1でDNAが切れません。
BamH1:20μl, DNA:1μg,バッファー:2μl
の系でやっていますが、泳動してみると変になります。
理由を教えて下さい。

622 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 18:04
変 って具体的には??

623 :切実に困っています:03/10/29 18:35
なんか真っ白けです。

624 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 18:48
>621
白いってなにが?

BamH1:"20μl", DNA:1μg,バッファー:2μl
なら確かにおかしいけどね。

625 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 18:55
フェノクロ抽出するとき
フェノクロは水性層に対してほぼ同容量加えないといけないものなんでしょうか。
事情あってもう少しフェノクロ層を減らしたい(フェノクロ:水層=1:2〜3)のですが。

626 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/29 19:15
俺はフェノ:水=1:1.5でやってて特に問題はない。1:2でも大丈夫そうだが。

627 :なんででしょう?:03/10/30 02:09
教えて下さい。チップつめのときつばをちょっと指先につけてやると素手でやっても
すべらないのでそうしていました。ところがこの間、指導者にいきなりひっぱたかれました。
何でですか?

628 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/30 07:24
今どき熱い師弟関係だな。
最近は実の親でも子供に愛のむちを入れる者は少なくなった。

629 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/30 09:10
郵便局とかにある湿ったスポンジは便利だよ。

630 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/30 19:19
タマキンに蹴り入れられないうちに
ラテックスグラブはめてからチップをつめなさい。


631 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/31 08:18
>>627
専用スレがあるな。

やっぱり朝はピペットのチップ詰めだよな その1
http://science.2ch.net/test/read.cgi/life/1067008780/

632 :名無しゲノムのクローンさん:03/10/31 16:40
>>627
釣りにしては弱いぞ。

633 :困っていること:03/11/02 21:30
オートクレーブをいくらかけてもばい菌が死にません。どうすればいいですか。

634 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/02 22:31
藻前は無菌実験不可。逝ってよし。

635 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/02 22:46
121℃で死ななきゃ122℃にしてみる。
それで死ななきゃ冷やしたら死ぬかも。
というか、菌だろ?
凍結融解繰り返したら死ぬから
液窒と圧力釜の併用でがんばれ。

636 :超遠心器が変です:03/11/03 02:44
いつも超遠心器を回すと、しばらくしてから物凄い音がして機械から
ブザーがなり速度もダウンしてきます。人があつまってきて文句をがみがみ
いわれます。どうしたらいいですか。

637 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/03 02:49
ちゃんとバランス取れや

638 :>>637:03/11/03 03:28
いつも大体同じくらいにはしてるんですけどね。

639 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/03 07:59
>638
“大体”同じ‘くらい’...の精度が他の人と違うのでは?

640 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/03 08:08
>>633
その菌研究すれば新発見あるかも?

641 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/03 11:18
>>633
ばい菌とばい菌じゃない菌の境目が気になった

642 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/03 14:41
>>633はばい菌じゃなくて有用菌ならオートクレーブで死ななくてもいいと思ってる?

643 :633:03/11/05 03:35
調べたらオートクレープの温度が表示と60度ずれていました。

644 :実験をはじめると不安になります:03/11/05 03:50
チューブに試薬をいれていくとき、いれたあとに"1","2"とかうんとして
いたとおもったら、いれるまえにいつのまにか"9"とか頭の中でいってしまって
います。どうしたらいいですか。

645 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/05 05:49
チューブに試薬入れる自分をビデオカメラで撮っておいてください。そして分からなくなったら、ビデオを見て確認してください。

646 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/05 06:58
となりのひとに
「いま何どきだい?」と
ときどき聞いてもらって下さい。

647 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/05 17:51
>>520 です。>>536さんの意見を参考に、特に2に関して検討しました。
挿入断片の3'側の余分な部分を減らす(100bp程)プライマーを作り治して
(カートリッジ精製グレード)PCR、 TOPOクローニング後に制限酵素で切って
ベクターに組み込みました(元はどれもBDで購入していました)。
昨日トランスフェクションしたところ、今日GFPが光っていました。
今回の結果、決定的だったのは、削った100bpだったと考えます。
そこに、スプライスサイト等があったのか:ただし、説明書にはそのような
記述がありませんでしたので、Stop codonからPolyAまでの距離が短くなった
事が成功した理由でしょうか。この考察は変でしょうか。
質問に答えてくださった皆さん有り難うございました。


648 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/05 23:16
僕は今までずっとエチブロいりのゲルを素手でつかんで扱うのが得意なのですが
この間それは危ないんだとかんなんとか偉そうなやつに因縁つけられました。
そいつはぼくが実験うまいのをねたんでいってきたのにきまっている。
こういうやつはどうしようもないよな。

649 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/05 23:29
エチブロはたばこより安全です

650 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 00:26
それは、火事の原因にならないからです

651 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 01:09
いやいや、お前さんがその手であちこちべたべた触るのが
気持ち悪いだけなんだってば。

652 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 01:12
>>647
藻前が将来どうなろうか知ったことではない。
問題は藻前が触ったところ(ドアノブとか)を触った後を自分が触るかもしれないってこと。

どうしても絵地風呂入りゲルを素手で触りたかったら、触った後に手袋していろんな所を触ってくれw

653 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 01:25
塩化カルシウムでコンピテンスになるなら他のイオンならどーだってことで
やってみたらFe=0はしょうがないとしてBa、Sr、Mgとか軒並み1.5e3/μgでRb=0
なのはまいった・・・ツーかCaですら1.5e4/μgだから俺が下手なだけか?

654 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 01:39
それだけあると炎色反応も楽しめそうでつね

655 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 01:56
なんでバレたんでつか?

656 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 06:04
高塩コンピテントでは実際もっと多くのイオンを試してるよ。
で結果が結局現状になった。

657 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 07:26
染色時の薄いEtBrはともかく
その前の濃いヤツはアレだな

658 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 15:49
>647
527です。実験うまくいきおめでとうございます。
多分その100bpにスプライスサイトもしくはpolyA付加シグナルなどが含まれていたのではと思います。
Retroviral vectorではLTRからLTRまできちんと転写されるコンストラクトが重要です。

659 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 22:17
ええと、今多発性骨髄腫の形質細胞培養株(RPMI8226とかKMS-18とか)を対象に
FISH法をやっているんですが、全然シグナルが光らなくて困ってます。
使ってるキットは藤沢薬品が扱っているVYSISシリーズ。標本はペプシン処理した
後で72℃×4minにてdenatureさせ、-20℃の70%EtOHで冷却→100%EtOHで脱水。
プローブは72℃×10min温浴でdenature、氷上で5分以上冷却させてからハイブリ、
37℃×18hでインキュベーション。
翌日、4xSSCで洗ったあと50%Formamide/2xSSCにて42℃×5min×2でdenature、
DAPIを染色して蛍光顕微鏡にて観察。で、DAPIの方は良く見えているのだけれ
ども、シグナルは全然見えず。

末梢血でプロトコルを教わったときはちゃんと見えたのですが、実験系を自分の
研究室に移し、対象を細胞株に変え、試薬も自分で調整するようになったら全然
上手く行かず、何が悪いのかと一度末梢血でもやってみたのだけれども、これまた
全然光らない。
denatureの温度やdenature solutionのpHを厳密に合わせたり、なるべく新しい
試薬を使ってみたりと細かい手技の抜けは全部埋めてみたつもりなのですが、ノイ
ズ以外は全然見えない状況になっています。
今後、どの辺を弄ってみるべきなのか……FISH法をやってる方居ましたら、是非
アドバイスお願いします。

しかし、末梢血で作った標本を-80℃保存しておいて後日解凍→染色しても問題
無かったのに、細胞株に変更したらdenatureの際に細胞が流れてしまうように
なったので摩訶不思議。現在は細胞浮遊液の状態で保存しておいて、染色の前に
改めて標本を作製する形で難を逃れていますが。

660 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 22:37
Plasmidを制限酵素で切るとき、何回やってもうまく切れず、
Ligationは成功しなかった。
作成したPlasmidの吸光度も波長の曲線も問題なく、
いつもと同じであったのだが…。
指導者である先輩が見かねて大腸菌を増やすところからもう一度やったら
すべてうまくいった。
いったい何が悪かったのかはいまだに謎…。

大腸菌か?

661 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/06 23:13
>>660
人(大腸菌)のせいにするな。
お前が悪いに決まってる。
もうちょっと注意深く実験しろよ。

662 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/07 01:24
>>660
エタ沈の後、エタノールちゃんと乾かしたか?

663 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/07 01:31
>>660
うちにはポスドクで、そおゆうひとがいます。
せんぱいがいるうちに、なおしてください。
まだまにあいます。

664 :?e?N?j?V?????I`?l??<eth>?c?e´?i¨?i¨?・:03/11/07 12:53
>>660 どうしてもうまくいかない時は手でじかに切ったり、
つないだりすることをお勧めします。

665 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/07 16:21
僕が2週間もかけて頑張って培養したプレートをみた嫉妬深いライバル
の研究者が、それはかびだよとか失礼なことをいっています。
誰か何か言ってやって下さい。

666 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/07 17:31
質問です
RNAもしくはDNA抽出の時にTEに溶かす作業があるんですが、
核酸はTEにすぐに溶けるものなんでしょうか?
ある程度時間がかかるのでしょうか?
御存知の方がいたら教えてください

667 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/07 17:33
2週間もかかってはえてくる大腸菌は
世界中の研究者が寄ってたかって入れようとして入らなかった
貴重なインサートが入ったプラスミドを持っているはずだ。
それは決してカビではない。
よぉく滅菌した爪楊枝で注意深くコロニーをかき取ろう。
コロニーが小さな丸い点ではなく
小さなクモの巣のように見えても気にしない。
なかなか入りにくいインサートを持った大腸菌は
丸いコロニーを作らないことがあるのだ。
コロニーをかき取ったら液体培地に植えて2週間振り続けるのだ。
頑張って成果を上げてほすぃ。



668 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/07 21:54
別の板で48時間放置されてしまいましたので、失礼ながらマルチさせて
いただきます。

『高校で地学を教えています

 岩石プレパラートの作成において、カバーガラスの接着するのに
 カナダバルサムを長年にわたって使用して来ました。
 今年になって、生物学の業界では『アクアテックス』(水溶性の接着剤)
 を使っている先生が多いと聞き、試しに使ってみたところ、大変使い易く
 感心しました。ただ、唯一の欠点は、バルサムを使用する時より、ナゼか
 時間がずいぶん経過した後にカバーガラスの下に気泡が発生する頻度が
 高いことです。

 生物実験の経験豊富な方、気泡発生を防ぐ、何かコツのようなものが
 ありましたら、教えてください。お願い致します。』


669 :?e?N?j?V?????I`?l??<eth>?c?e´?i¨?i¨?・ :03/11/07 23:29
>>667 ありがとう。きみは僕のみかたですね。

670 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/08 12:17
>>666
マジレスすると
高分子のゲノムDNAは溶けにくい
室温で半日ぐらい放置
BACかなにかに入れる予定なら冷蔵で長時間書けてゆっくり溶かす

RNAや低分子のプラスミドなどは溶けやすい
適当にボルテックスすれば溶ける


671 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/08 15:08
>>668
気泡については分からないのですが、アクアテックスは大きい試料を封入すると
周囲にヒビを生じさせる事があります。
この対応策としてはアクアテックスの使用量を極力少なくすることが一般的です
が、極少量のグリセロールを混ぜてみることでも解決すると聞いたことがありま
す。

672 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/08 18:24
石に空胞があるんじゃないの?


673 :s:03/11/08 18:33
C:\Documents and Settings\Administrator\デスクトップ\1_4_2.gif

674 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/08 22:37
ミニプレップでとったのこりかすの菌で大量培養一晩、キットでDNAとったら
ほとんど回収されません。どうすれば?

675 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/08 22:54
>>674
>>2を見ろよ。しっかり書いてあるじゃん。


676 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/08 23:34
カスならいいじゃん問題なし

677 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/08 23:59
ミニプレップする際に100μlくらいグリセロールストック作るんじゃないの?

678 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/09 02:08
>>674 >>2より」いい方法あります。ミニプレップでとったDNAを
新たにtransformし大量培養するんです。

679 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/09 02:27
ミニプレップで獲らなくていいじゃん!

680 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/09 02:34
ミニプレップでとって切ってクローン選びますよね。その時の残りのDNAです。

681 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/09 08:11
時間的には同じ
(プレート1晩+液体1晩)
だけど
トランスフォーメーションする分だけ
手間はかかる


682 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/09 09:51
なんでそんなことが起こるのかってことを考えないで、解決策モドキを
出してくるのは科学的な態度とは言えませぬ。>>2はそこそこ良い線
いってるけど、なんでプラスミドが落ちた菌がアンピシリン入りの培地
で増えてしまうかの説明が欠けている。これは、アンピシリン耐性遺伝
子の産物であるβ-ラクタマーゼが細胞外酵素で、O/N cultureすると培
地の中に蓄積していることによる。こんなものを、1/100 vol.も持ち込
んだら、植菌した瞬間にアンピシリンが不活化されてしまう。選択がか
からないので、プラスミドを落とした細胞が増えてしまうというわけ。
だから解決策は、プレートから直接植菌するか、large scale culture
に移す前に、菌体をアンピシリン入り培地などで洗うこと。

683 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/09 22:00
>>682  じゃあなんでだいたいの場合はNOKORIKASUでいいんだい?

684 :質問:03/11/09 22:03
λパッケージングで6kbのplasmidで大腸菌をトランスフォームしようとしてます
よろしいでしょうか。

685 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/09 23:55
>>683 プラスミドが大腸菌の生育にdisadvantageを与えない場合は、もちろん積極的には排除されないよ。そんなことも分からんか。

686 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/10 02:09
>>685 disadvantageを具体的分子の言葉で説明して下さい。

687 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/10 09:19
そんなもんケースバイケースだろ。プラスミド持ってる細胞のdoubling timeが持ってない細胞のdoubling timeより長いこととしか定義できねえよ。

688 :質問:03/11/10 15:41
ハイブリダイゼーションに使うプローブを合成しています。
その際、DNAマーカーの泳動パターンからRNA合成量の見積もりを行うと本に書いてあったのですが、
実際どのように計算すればよいかわかりません。
例えば0.5mg/mlのマーカー(100-3000bpのバンドが出るやつ)を使用したときに、
100-300bpのところにプローブのバンドが出たとします。この場合どのように計算すればよいのでしょうか?
よろしくお願いします。

689 :>>687:03/11/10 19:21
それだけ?

690 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/10 19:38
>688
www.shimadzu-biotech.jp/datahall/research/sr57-121.pdf
の125ページでも参考汁!

というか,ぐぐったり図書館で調べてから(ry

691 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/10 19:57
λパッケージングでplasmidをトランスフォームしましたがno colony
でした。何でですか。

692 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/10 20:34
20%のSDSポリアクリルアミドゲルに
BPBを含んだサンプルバッファーを入れ熱処理あいた試料を流すと
濃縮ゲルから分離ゲルに移行する時点でBPBの線が完全に消えてしまい
(12%のゲルならこんなことはないのですが・・・)
すぐゲルの中央部にごく細いBPBのバンドが来ます
これがゲルの下端から5mmのところに来た時点で泳動を停めて
染色すると泳動が途中までしかできていません

これではどこまで泳動を続けてよいか皆目わけがわからなくなります
どうすればよいのでしょうか?
予備実験で泳動時間を切って染色、この繰り返しで泳動すべき時間を推定、
という方法も考えられなくはないですが
これでは時間も手間もかかりすぎます・・・

693 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/10 21:28
>692
pre-stainedマーカーを一緒に流したら?

694 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/10 22:53
>691
文中に必要な情報がないのですが、コスミドをパッケージングして
transformしたということでしょうか?
もしそうなら、全長6kbのコスミドは短すぎてパッケージングされるはずが
ありません。

695 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/10 22:56
>692
固まるのが早すぎてゲルがゆがんでるのでは?
そんな濃いSDS-PAGEやったことないのでわからんが
泳動パターンは大丈夫か?

696 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 01:19
>>693
さっそく参考にしてみます

>>695
作ってすぐ20mAの定電流で泳動にかけたのですがスマイリングが激しく・・・
精製蛋白を濃縮ゲル中でV8プロテアーゼ処理し泳動、PVDF膜に転写して内部一次構造を調べるので
このような濃いゲルを使うのです
転写もセミドライ式のエレクトロブロッティング装置を使い
緩衝液はTris-MeOHを使って0.8mA/cm2で1時間やるのですが
この転写もうまくいっていないのはゲルが濃すぎるからでしょうか


697 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 02:35
>>694 コスミドではなくてcos siteのないplasmidです。

698 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 02:48
>>697 何回もやるときっとうまくいくよ。

699 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 03:03
>>692
・ゲルがきちんと混ざっていない
・分離ゲルに入れるバッファーの量を間違えている(少ない)
・サンプルバッファーの組成がおかしい(塩濃すぎ、pH低すぎ)
・サンプルのpHが低すぎる
・サンプルの中にグアニジン塩が1M以上入っている

Tris-tricineならともかくTris-glycineで20%は15〜18%と比べて分離は
小さい分子量の辺り(<6kD)でもそんなに変わりなかったと思うが。

700 :?e?N?n?V?????I`?l??<eth>?c?e?L?i?N?i?N??E:03/11/11 11:00
>>694 私は4kbのplasmidをいつもパッケージングでtransformしてますが。

701 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 21:49
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702 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 21:49
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703 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 21:50
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706 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 21:52
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中田英寿態度がでかいぞ中田英寿態度がでかいぞ     

707 :sage:03/11/11 22:26
sage

708 :sage:03/11/11 22:26
sage

709 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 22:27
中田英寿態度がでかいぞ中田英寿態度がでかいぞ
中田英寿態度がでかいぞ中田英寿態度がでかいぞ
中田英寿態度がでかいぞ中田英寿態度がでかいぞ
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中田英寿態度がでかいぞ中田英寿態度がでかいぞ

710 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/11 23:39
蒸留。それにみんなの高度な知恵についてけない。


711 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/12 12:28
寒天培地のプレート(寒天は1.5〜2g/100ml)をつくっていて、ときどき異様にやわらかくできてしまう場合があります。
寒天の濃度や、オートクレーブの時間などはいつも同じにしているはずなのですが、寒天を固める時の室温が
違うとやわらかくなってしまうのでしょうか?

712 :占い師:03/11/12 12:31
あなたはlow melting agaroseを使っていますね

713 :ririn:03/11/12 14:20
Beckman CEQ2000を使っているのですが、うまく読めません。

714 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/12 14:48
液体培地へのコンタミ激しすぎ!
クリーンベンチでもコンタミするってどういうことだ、説明汁!

715 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/12 17:40
お前が汚いからだよ

716 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/12 18:55
>>713
ユーザーの少ないマシンは
情報も少ない


717 :ブリ:03/11/13 02:32
ラボにはいったばかりの者です。実験がうまくいくとかいかないとか以前に
ラボの人間の態度が非常に気に入りません。タカビーな態度でものをおしえにくるやつら
一触即発で怒りが爆発しそうです。こんなんで実験なんて手につきませんなー。

718 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/13 09:12
>>717
じゃあ、自分で調べて実験したら?
漏れはあまりにむかついて全部自分で調べてやったよ。
で、わからないところだけ適当な人をつかまえて聞いたけど。

719 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/13 09:28
>>711 培地は何? LB?

720 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/13 17:36
微生物ゲル地培養用標準培地です。

721 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/13 21:47
寒天とBacto Agarだとだいぶちがう。でも、ものすごくちがうのなら
濃度を間違えているはずです。

722 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/13 22:12
>>720 何だよ、標準培地って。具体的に書かないと分かんないよ。

723 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/13 22:44
>>722 トリプシン含有LBです。

724 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/13 22:50
もういらいらしてたまらんからレスするけど、

>>723
情報の小出しはやめなよ。

>>722
それが分かって解決できるんかい?いやできないだろ。
俺はできないと思う。

まあどうでもいいんだよ。スレ汚しすまないね。

725 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/14 08:55
培地によってはpHが低くて寒天が加水分解されて固まりにくくなるものがある。LBなら違うだろうけどね。でもそれは、聞かなきゃわかんないだろ。
ところでLBに消化酵素いれてどうすんの? >>723

726 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/14 09:15
トリプトンとトリプシンを間違えたと思われ
LBにもレシピが何通りかあってバクトトリプトンつかうか
バクトペプトン使うか両方いれるかとか、そういう
問題と思われ

727 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/14 09:24
68へー。知らんかった。ところでトリプトンとペプトンって、何が違ってどう使い分けるの?詳しい方、教えてください。

728 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/14 10:25
フロキシンBって、pHによって染色効率って変わります?

729 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/14 20:31
RT前のDNaseでつまづいています
説明書で10Uのところを100Uで行っています。
でもRT-のサンプルでPCRを行うとバンドが出てしまいます
DNaseの失活は新品を使ったのでないです
DNase処理後のエタ沈で12000rpmのところを14000rpmでやってます
まわしすぎると余分なものまで拾ってしまうのでしょうか?
それともDNaseが多すぎるのでしょうか
どなたかアドバイスお願いします


730 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/14 21:38
なんで 10 U でやらないの?
なんで 12,000 rpm でやらないの?

731 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/14 23:05
>729
>505を参考にして下さい。
あと酵素はグリセロールの入ったストックバッファーに入ってるから
反応系に持ち込む量が多くなればそれだけ反応の邪魔になるよ。
あとDNase処理後にエタ沈って必要なんだっけ?
私が使ってるプロメガの奴は必要ないよ。


732 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 01:28
彼女が30過ぎてもできません。ヤッパリ我々はもてない世界なのか?

733 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 02:56
>729
731は御尤も。
あと失敗する原因はRNAが汚いこと。
RNAサンプル量、濃度が高いと不純物の影響でDNase作用が弱くなる。
酵素反応が弱い時は反応容量を増やしてサンプル濃度を薄くするのが基本。
個人的にはアンbionのDNaseがお勧め。

もしDNase条件検討するつもりがあるのなら、
同RNAサンプルに少量のDNA(プラスミドなど)混入
 →DNase処理
  →電気泳動でDNA分解確認
    RNAサンプル(+)で(−)DNA分解程度を比較。

どうしてもDNA混入が解決しない場合には、RT-PCRプライマーをイントロン挟む位置にすれば、
実質的にDNA混入は問題無くなる。

734 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 06:38
>>732
モテないのはこの世界にいるからではない(我々というな!)
どの世界にいようが個々の人間の問題。
要は惹きつける要素がないから。

735 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 11:39
・・・マジレスかよw

736 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 18:29
ゲル回収の時に、UVってどれくらいの時間照射しても問題ないのでしょう??
20分くらい当てて回収し、TAクローニングを行ったところ、異常に効率が悪いのです(コロニーが20個くらい)

737 :校長が強盗:03/11/15 18:55
この事件は報道されていません。教育委員会も校長を処分しません。
 皆様の力でこの事件を広めてください。
被害者先生のサイト
 http://www.geocities.co.jp/NeverLand/8595/
 事件究明を求める署名サイト
 http://chiba_273.at.infoseek.co.jp/
   ∧_∧
  (  ^^ )< ひろめよう


738 :起原切れ助手:03/11/15 19:02
>736
20分は多過ぎ。
UV使うならせいぜい2、3分てとこか(それでも長い)。
できればUV使わないで済む色素にかえた方がいい。
たしか、ウルトラバイオレットってのがあったと思う。
調べて見れ。
ちなみに俺はエチブロでも蛍光イメージャーでやってる。


739 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 20:24
ウルトラバイオレットじゃなくてクリスタルバイオレット

740 :起原切れ助手:03/11/15 20:26
そそ、それそれ。
さんくす。

741 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 20:50
て有価
切り出しに20分もかかんの?
もたもたすんなや


742 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 20:53
ネタでしょ。どうせ。

743 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 21:08
UVによる損傷を防ぐために、DNAの染色にクリスタルバイオレットを使用することに関しては例えば次を参照。
www.nibb.ac.jp/~evodevo/5-19.html

744 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 21:11
ゲル回収で紫外線なんて使ってないよ
変わんないもん

745 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 21:14
は? どうやって可視化されてらっしゃるんで?

746 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 21:15
うちは蛍光じゃなくてそのまま見えるやつ使ってるから

747 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 21:16
↑は俺じゃないよ
見てなくてもいいじゃん
下手糞さんですか?

748 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 21:18
見ないで切り出しっていったいどうやって? この辺だろ、えいっ!って感じですか?

749 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 21:25
ずっと当てておく必要ないだろ
阿呆サンでしょうか

750 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/15 21:29
言いたいことがやっと分かりました。しかし、下のようなことを書いておいてその内容が伝わると思うのは、かなり特殊なお考えかと思います。

> ゲル回収で紫外線なんて使ってないよ
> 変わんないもん

751 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/16 00:22
普通にクローニングの質問

ブラントにcutしたvectorはクローニングは難しいですよね?

コツ、教えてください。

752 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/16 02:38
脱リン酸化をしっかりする
ライゲーションを長くする


753 :げるにばんどがでません:03/11/16 03:31
えちぶろをかなり多めにとけたあがろーすいんいちかけTAEにとかして
げるつくってますが、ぽじこんのDNAも全くでませんどーしてですか?

754 :753についか:03/11/16 03:34
もちろんえちぶろもおーとくれーぶしてるのできんとかにDNAくわれている
んじゃないともいます。

755 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/16 03:40
>>753,754
釣り?

756 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/16 10:38
>>751 PEGの入ったligation bufferを使う

757 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/17 07:04
てゆうか
普通にライゲーションキット使ってれば問題ないし


758 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/17 08:00
>>757
うちのラボ、金ないからってライゲーションキットすら買ってくれねえ…
幾らなんでもインキュベーターが十年ものって冗談じゃないよ…

759 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/17 09:26
インキュベーターなんてふつう10年前から変わってねえだろ。

760 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/17 16:43
10年前から同じチップを洗ってるなら凄いが。

761 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/18 03:39
>>758

ライゲーションキットの方が安く行かないかな、3ulの反応系とか。

762 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/19 02:03
ブラントエンドライゲ−ションが何度やってもうまくいきます。
私はちょっとうまいんでしょうか?
私の将来性を教えて下さい。
ワクワク。

763 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/19 14:23
>>760
チップもチューブも6年物ですがそろそろヤバイっすか?

764 ::03/11/19 14:33
壊れるまで使ってやるが愛ってもんだろ

765 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/19 18:51
>762
文章が下手だね。留学生ですか?

766 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/19 22:35
イムノブロットによる転写の結果をPCに取り込みたいのですが、バンドの色が薄く認識されません(白トビしてしまいます)。
何かうまい方法はないでしょうか…?

767 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/19 22:52
現状何によって取り込んでいるの?
コントラストを上げればよいだけだと思う

768 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/19 22:58
スキャナで取り込んでみたのですが全くダメです。コントラスト上げると、背景も灰色になってしまい全体的に色が潰れてしまうのです…。

769 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/19 23:04
>>768
なんかよくわからないけど、バンドの色を濃くするようにしたらいいんじゃない?
ECL使ってるなら長い時間露光すればいいしさ。
抗原の量増やすとか。
あとはプォトショップ使うとか。

770 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/19 23:26
そうなのですが…
諸事情により、やり直しはできないのです。既に転写し終え、薄くなってしまったバンドの色を濃くする方法を知りたいのですが…
かつ、背景は白いまま、です…

771 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/19 23:59
>770
よっぽどその結果に自信があるのなら、別の(まったく異なる)タンパクのサンプルでも使って
それらしきウエスタンの写真を再現したらいいんじゃない?
でもまあそんなことしていいのは卒論くらいまでだわなあ、なんていったら集中砲火あびてしまうかも。

そもそもやり直しができないってことだけど、それじゃあ再現性の検討ってどうやってするつもりだったんですか?

772 :ウェスターンができません:03/11/20 02:17
同上。どうすればいいですか。

773 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/20 02:22
コントラストじゃなくてガンマ値のほうはどうよ?

774 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/20 07:42
>>770
やり直しが利かないって・・・
再現性も確かめずに発表するの?

775 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/20 09:14
>774
たぶん770は卒研生で、いまから転写実験やったら卒論に間に合わないということなのではないだろうか。
だからといって再現性を確かめなくていい理由にはならないのだけど。

776 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/20 11:56
物凄くレベルを下げるお話なんですが、小型のホモゲナイザー(ガラス製のやつ)って使う時に
必ず緩衝液が必要になるんですか?ちなみに試料は凍結乾燥させた神経なんですが。

777 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/20 17:35
ブラントエンドライゲ−ションは何度やってもうまくいきます。
私はちょっとうまいんでしょうか?
私の将来性を教えて下さい。
ワクワク。


778 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/20 17:37
液窒+乳鉢+乳棒。
ホモジェナイザなんて登場しないよ。

779 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/20 18:30
酵母のCVT測定にウェスタンブロッティングつかってるんですが…
飢餓って飢餓培地4h培養で誘導されますかね?

780 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/20 21:01
>778
その方法をしている人を見ますけど、再現性はあるんですか?
かなりばらつきそうな気がするんですが。

776ではありません。

781 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/20 21:31
>>780

ルーチンで>>778の方法で細胞破砕液を調製しているが、
破砕する時間とか試料の量を決めてやれば誤差は少ない。

782 :776:03/11/23 16:26
>>778
ありがとうございます。

783 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/25 17:33
pETでの発現系に取り組んでいるのですが、コロニーPCRがうまく行かないことがあります。
誘導をかけてない場合でも少し発現してしまっているタンパクが邪魔してしまっていると
考えているのですが、そのようなことは往々にして起こることなのでしょうか?

784 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/25 17:51
コロニーを大きく引っ掻き過ぎなんでは?
培地の成分にPCRを阻害する物質が含まれているらしい。

785 :783:03/11/25 18:24
引っ掻くと言うよりもつつく、という感じでやっているのですが・・・
それでも培地が入ってしまうのでしょうか?

786 :起原切れ助手:03/11/25 18:37
えーと、1)培地にPCRを阻害する成分があるのでつつかないようにする。
2)菌にも阻害する成分が含まれている可能性があるので、ほんのちょっと触れるだけにする(それでじゅうぶん)。
3)ポリメラーゼを変えてみる。例えばVentで行かなかったのが、KOD Dashでバンドが出た、なんてことはしばしばあるようだ。

787 :783:03/11/25 20:18
なるほど、わかりました。
試してみます。どうもありがとうございました!

788 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/25 22:30
KOD' でのコロピーについて追加
酵素は1/4ぐらいにまでけちれる
伸長時間は長めにする
500-1000bpぐらいのインサートなら2分
1キロ1分が目安って
その通りやったらヒット率5割
それが倍に延ばしたらヒット率9割


789 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/25 22:48
KODはfidelityが高いという点では良いけど、結構気難しいところがある酵素だぞ。コロピーならExTaqあたりがrobustで良いんじゃないか?

790 :厨1:03/11/26 04:27
かかるやつはかかるし、かからないやつは精製したプラスミドでもかからない。
制限酵素で切るとちゃんと目的のサイズのフラグメントが出るし、
そのプライマーでちゃんとシークエンスも読めるのになぜだ〜? 


ということは、うちでは頻出です。

1ヶ所切って開いておいてからやるほうがかかりがいい、とか、あるのかな。

>>783
5mLほど使ってミニプレしてみればええんでは?

791 :783:03/11/26 11:12
>>788
 今は自作のTaqを使っています。
とりあえず、それで問題なくPCRできていますが、他のも使ってみたいと思います。

>>790
 スクリーニングに使うので、なるべく手間暇をかけたくなくて・・・
でも、どうにもならない場合はミニプレしています。

792 :起原切れ助手:03/11/26 11:49
>790
「なぜだ〜」に関して、どう解釈していますか?

コロニーPCRの際の阻害物質の持ち込みではなくて、プラスミドの高次構造なんですかね?
だったらやっかいそうですね。

793 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/30 14:30
>790
単に PCR 産物の大きさが大きすぎて PCR で増えないだけでは?
PCR しないでシーケンス反応はかけられるみたいだし・・・
シーケンス反応かけられる所をみるとプラスミドの高次構造
ではないような気もします。まぁ高次構造なのかもしれませんが。

794 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/30 14:44
>>791 自作TaqでのPCRは訴訟沙汰になるよ

795 :さすらい人:03/11/30 14:50
みなさんにお聞きしたいのですが、どこの会社の ligation kit が
お勧めでしょうか?当研究室では TOYOBO の Ligation High と TAKARA
の ver.2 が主に用いられてるのですが・・・・
もっと効率の良い Ligation kit を御存知の方誰かいたら
お返事お願いします。

796 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/30 14:52
TaKaRaのver.2で決まり。っていうか、そんなこと比較試験してるよな奴がいるのかよ。

797 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/30 15:49
>>795
個人的な意見ではTAKARAのものではくっつかないような場合でもTOYOBOのLigation highの方がくっつくという
経験があります。だからLigation highはお勧めです。
他の会社は知りません。やったことないので。

798 :名無しゲノムのクローンさん:03/11/30 17:53
普通にやってりゃどれだって十分な効率だと思うが。他の実験操作に問題があるんじゃないか?

799 :さすらい人:03/11/30 18:20
>>798
約 14 Kbp の大きめの vector に約 7 Kbp の inverted repeat 構造
を持つ insert を ligation したいのですが、なかなかしないのです・・・
ちなみにクローニング site は Xho Spe しかありません。
TAKARA のカタログをみると Xho は少し ligation しづらいみたいです。
きっと vector 及び insert の大きさ、 inverted repeat、Xho の
クローニングサイトといった不利な条件が重なって ligation がほとんど
しないのだとは思うのですが・・・
どなたか良い情報やアイディアはないですかね?

800 :800:03/11/30 18:56
嘘800

801 :名無しゲノムのクローンさん :03/11/30 19:32
EMSAなんですけど、初めてやったときにはシフトバンドがでたのですが、
二回目以降、全く出なくなってしまいました。そしてなぜか、negative controlではバンドが出る!
どなたか、同じトラブルを克服された方、アドバイスしてください。
ちなみにDNAのsizeは150bpと少し大きめ。

802 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/01 09:31
>>799 長いinverted repeatを持った配列はクローニングし難いことが良くある。StratageneのSUREっていう大腸菌を試してみたら?

803 :さすらい人:03/12/01 16:18
>>802 その inverted repart には Invtirogen 社の GATEWAY Casette が入っているため DB3.1 という大腸菌の株でしか安定ではないんですよ。Sure2 とかを本当は使用したいのですが、そういうわけにもいかない
のですよ。
私は GATEWAY technology を熱く信奉しております。

804 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/01 19:59
Iam sure too.

805 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/01 20:50
緊急に質問です。

キーワードは、脳、海馬、マウス、行動

海馬依存性の学習って、モーリスの水迷路学習、Lashley III maze意外にありますか?

できる限り簡易的にできるタスクを知っている方がいたら教えてください。

806 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/01 21:57
緊縛に詰問です。

キーワードは、膿、海鼠、フスマ、行水

河豚異存製のが九州って、モームスの水餃子照焼、Sa Lash III age以外にありますか?

できる限り歎異的にできるタラコを知っているか互いたら押してください。


807 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/01 23:54
エタ沈の質問。
100%EtOH入れるとき、
核酸の溶液に対して、どれくらいの量を入れてますか?
ついでに、どんなp.p.tがよいp.p.tで、
どんな形のp.p.tだと悪い例になるのでしょう??
あと溶液の白濁具合とか。

808 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/01 23:57
どのくらいの量も何も70-75%以外に何があるのか?

809 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/02 02:29
角度とか。って思い出してワラタ

810 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/02 18:53

N県のK山君へ:

糞コテハンのときは丁寧語で書き、地震のないときや罵詈雑言を並べるときには名無しで書く、
N県のK山君。
きみがこれ以降汚らしい書き込みをするのであれば、きみの上司やきみのところの院生に
きみのこれまでの書き込み集を見てもらわなければならなくなる。

811 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/02 22:09
?


812 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/04 01:41
>>810 やれるもんならやってみろ

813 :名無しゲノムクローンさん:03/12/05 14:26
RNA抽出して得られたRNAの純度を調べたところ260/280は1.9とタンパクは除去
できてるのですが260/230が0.6程度と多糖類が除去できてませんでした。
そこで質問なのですがこのRNAから多糖類を除去するにはどうしたらいいのでし
ょうか?LiCl処理がいいのではという話は聞いたことあるのですが手順がわかり
ません

814 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/05 16:07
RNA中のゲノムの除去に何回もつまずいています
反応容量を10倍に増やしてサンプル濃度を薄くしていますがゲノムが除去できません
DNase処理後のサンプルをRT±でそれぞれRTしてそのサンプルをPCRでバンドの有無を確認しています
アクチンのプライマーを用いていますがどうしてもRT−でバンドがでてしまいます
前は全然でなかったのですが・・・
酵素も新しくしました
どなたかアドバイスお願いします


815 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/05 19:43
>814

>502 >729あたりを見て下さい。
サンプル量も減らしてるみたいですし、あとはRNAの純度かなあ。



816 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/07 00:50
おっさんで悪いが、DNaseでゲノムを完全に0に出来るものなの?

817 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/07 01:44
260/280は知ってたけど、260/230は知らなかった。
これは何を意味する値なの?


818 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/07 09:26
こりゃひどい・・・

819 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/07 14:58
>>813
5MのLiClを1/10量加えてボルテックス後
フェノクロ。かなり量が減ります。

820 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/09 10:47
His-Tagをつけた融合タンパクを大腸菌で発現させました。
発現タンパクの酵素活性をみると、どうやら培地に多く分泌しているようなのですが、
His-Tag精製がうまく行きません。
LB培地を使っているのですが、培地中に精製を阻害する因子が含まれていたりするのでしょうか?
どなたか、アドバイスをお願いいたします。

821 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/09 11:23
実際に目指すブツにHisタグがついているかどうか培地成分を抗Hisx6抗体でイムノブロットしる

822 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/09 20:26
1.5kbaseのPCR産物をプライマーとして、全長3kbaseの遺伝子をPCRで
増幅させたいのですが、アニーリング温度はどれくらいに設定したら
いいでしょうか?GC含量は37%です。Fプライマーは普通の20kbaseくらい
です。そもそもこんな大きなプライマーで増えるのでしょうか?
教授はやってみろというのですが・・・

823 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/09 20:46
>822
何をしたいのかがイマイチわかりにくいけど、重複した領域を持つ1.5kと3kのフラグメントから
PCRによって約4.5kのフラグメントを作りたいってこと?
それをやるなら1.5kと3.,5kのそれぞれのフラグメントの重複しない側の端に設計したプライマーセットで
PCRをかけるんじゃないの?
テンプレートは1.5kと3kを適当な比で混ぜて希釈した物を使い、温度はいろいろ試してみる。
これであってるんかなあ。

何をしたいかもう一回整理して書いたほうがいいよ。

824 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/09 21:01
すみません。823さんのおっしゃっていることとは違います。

整理して書きますと、
3000baseの遺伝子の中央部分に一箇所(1500とします)のポイント
ミューテーションを入れようとしています。
手順として、、、
@1500-3000までを増やします
(このときのプライマーをいじって1500にポイントミューテーション
が入るようにしています)
AこのPCR産物をRプライマーとし、Fプライマーとしては1-20の
合成オリゴヌクレオチドを使い全長DNAを増やします。

@の産物のGC含量は37%です。このときアニーリング温度は
どれくらいに設定したらよいでしょうか?

825 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/09 21:12
>824
てきとう。
というより,Fプライマーのほうがアニールしにくいだろうから,そっちに従う。
余力があればアニール温度ふれば?温度グラディエント機能があれば楽。

826 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/09 21:17
死体が蘇生しない・・・

827 :823:03/12/09 21:53
>824
了解しました。

ただ私がそれをやるとするなら
(1)A:1-1525(1500に変異)とB:1475-3000(1500に変異)をPCRで作って
つまりこの場合(50bpのオーバーラップ)を設定して
(2)AとBを適当に混ぜて希釈して.......以下前述
とやるんですけどね。

まあ細かい条件に関してはどちらにしてもトライしてみるしかないですし頑張って下さい。

828 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/09 21:59
>>827
A:1-1525(1500に変異)とB:1475-3000(1500に変異)を等量混ぜて普通にハイブリ
してクローニングでいいと思うけど。
わざわざFのプライマー使わなくても。

829 :828:03/12/09 22:01
訂正。
ハイブリ後、DNA polymeraseで伸長したあと、プラスミドに入れるね。

830 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/09 22:07
827の方法はアニール&伸長した断片を,
さらに両端のプライマーによるPCRで増幅できる。
長いプライマーが切り出しとかで少ないときには有効。
漏れはそうやって変異入れてる。

831 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/10 01:48
10cmdishに細胞が一匹いるんですが何日たっても増えません。

832 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/11 01:37
今日も一匹でした。

833 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/11 15:38
プロテインシークエンサーがラボにないので
精製蛋白の一次構造解析を外注したいのですが
どこが最も安くできますか?
一度失敗するとラボの方針で数ヶ月はさせてもらえないので
できるだけ金銭的に負担をかけたくないのです・・・

834 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/11 18:14
>833

確かここやってる、
http://www.hisco.co.jp/bio/
HPにないけどメールでも出してみれば?

835 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/12 00:16
>>831
鼻糞やろ

836 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/14 23:43
技術で選ぶならAPROだな
http://www.aprosci.com/


837 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/15 18:14
ELISAを行うと検出されるシグナルが弱いのですが、
どうしたらはっきりとしたシグナルが検出されるでしょうか?
最初のタンパク質のコーティング量を多くする、
また、抗体の希釈倍率を下げたりすればいいのでしょうか?

838 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/16 11:13
現在、癌に関する研究を行っております。ある遺伝子をノックアウトして得た
マウス繊維芽細胞がトランスフォーメーションを起こすことがわかり、さらにこ
の遺伝子をレトロでもどしてもトランスフォーメーションは改善されなかったことから
この遺伝子の欠損により、ゲノムが不安定になり変異を起こしやすくなっている
のではないかと考えています。
そこで質問なのですが、ゲノムの安定性をできれば簡便に検証するような方法
をどなたか御存じありませんでしょうか?
たとえば、X線を照射したときのような場合におこるゲノムへの障害を数値化する
など、、、
なんらかの方法を御存じのかたもしおられましたらよろしくお願い致します。

839 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/16 12:24
3kbaseのDNA1ugは、何molでしょうか?
そういう一覧表が載っているWEBページ/教科書とかありませんか?

840 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/16 12:55
>839 高校生は他のスレで質問しましょう!

841 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/17 00:03
>839
ToyoboかNEBのカタログ、後ろのほう

842 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/17 00:20
>>839
つーかそれぐらい計算できないとまずいでしょう。
1 bpは平均してどれくらいの分子量でしょう?
まあ一般的には660ですね。
それを利用して計算しましょう。


843 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/19 19:51
BSAは5年くらい前に蓋開けたもの使っても問題ありませんか?

844 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/20 00:22
目的によりけり

845 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/20 00:32
保存方法によりけり。

846 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/20 07:41
原産国によりけり

イタリア,フランス,イギリス,ドイツあたりだと
変異型プリオンを含む可能性があるので
陰圧にした室内で防護服を着て扱います

当該品を含むもの,当該品を取り扱った器具等はドラム缶に封入して地層処分します

なんちて



847 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/20 16:50
どなたか良い知恵をください。

あるプロモーターをルシフェラーゼ発現ベクターに組み込み転写調節についての解析を
しています。
プロモーター領域のdeletionを作成して目的としている調節領域(約40base)は特定しました。

いまはその領域内の転写因子結合配列変異体を作成しようとしているのですが、
GC-contentがあまりに高く(GC:90%以上)通常の変異プライマーと制限酵素Dpn Iを
用いたsite-directed mutagenesisではうまくいきませんでした。(コロニーすら現れず)
site-directed mutagenesisは他のplasmidでは成功しているため手が汚いわけではないと思います。

また、2〜3組のオリゴヌクレオチドカセットを使ってカセット変異を行ったのですがうまくいきませんでした。
おそらくあまりにGC-contentが高いためoligoがうまくハイブリしていないのでは思います。

なにか点変異か2〜3塩基変異を入れられる良い方法はありませんでしょうか?



848 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/20 17:03
お前ら流行りモノの光りモノが好きやな

849 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/21 18:12
>847
KOD Polymeraseで増やして何とかするといいかもしれません
すごいGC Richなものを増やしてうまくいった人が居りました
こんなんじゃ解決できないかな?

850 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/21 18:20
847です。
>849 レスありがとうございます。
一応,fidelityの高いPfu turbo polymerase
を使用したのですがうまくいきませんでした。
恐らく増幅配列中がGC-richならKODで大丈夫だと思いますが、
目的上、プライマー自体がGC-richになっているのでうまくアニーリングしていないのだと思います。

851 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/21 18:37
コロニーハイブリやってる奴っている?

852 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/21 19:58
最近やんなくなったな。データベースで配列探してPCRしちゃう。長い遺伝子でも、pooling & sib-selectionのための検出方法としてPCRを使えば、PCRのerrorも問題にならない。1週間ほどかかるけど、実労1時間/1日の仕事だから。

853 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/21 20:59
>>852
pooling & sib-selectionて何ですか?教えてもらえませんか?

854 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/21 22:39
プラスミドのライブラリーを10^6 cloneスクリーニングするつもりな
ら、そのオーダーのtransformantが出るように大腸菌に形質転換し、
10^5程度ずつのpoolを2 ml x 24本に植菌してO/N culture。翌日2 mlの
うちの1.5 mlを使ってmini-prepして、どのpoolに望むcloneが入ってる
かチェック。positiveだったpoolの残りの0.5 mlを希釈して、今度は
10^4ずつ24本に植菌して、mini-prep、PCR。positiveだったpoolを希釈
して…と繰り返して、10^1オーダーになったらplateにまき出し、最後
はcolony PCR。1週間でsingle cloneに行き着く計算です。

855 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/22 19:19
急に、pH4.0、5.0の緩衝液が必要になりました。

「浸透圧比は1」

で、(低pH)以外の毒性がない緩衝液って
なにかありませんでしょうか?

可能な限り、緩衝作用は強いのでおながいします。
(バルビツール緩衝液は不可の方向で)

よろしくおながいします。

856 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/22 21:25
プロテインA融合の蛋白を精製したいと考えているのですが
いい手が浮かびません。
やはり担体に適当な抗体を結合させて
クロマトかけるのがベストでしょうか
お教えねがえませんでしょうか」


857 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 00:03
HEPES
PIPES


858 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 10:24
>>856 担体にIgGを共有結合させたビーズが市販されています

859 :856:03/12/23 10:51
>>858
ありがとうございます。
もしよろしかったらメーカーを教えていただけませんか?

860 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 12:30
ちょっと探せばいろいろ出てくるよ。
IgG agarose bead suspension (SIGMA A2909)
IgG sepharose (PHARMACIA 17-0969-01)

861 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 12:42
ピアスがいいよ

862 :856:03/12/23 13:16
ありがとうございました。
とりあえずsigmaでやってみることにします。


863 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 15:26
プロテインA融合タンパク質で発現するってあんまし聞かないね。

ふつう、GSTかHisx6かmaltose-binding proteinとかあるいはFLAGかHA
,mycあたりにしないか?

864 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 16:39
TAP-tagを知らないのか?

865 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 17:31
というか、人が何くっつけようがいいじゃん。

866 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 18:24
すごく基本的なことなんですけど、遠心で12,000gX30minと15,000gX20minを比べるとき、
単純に掛け合わせて、360,000>300,000だから、前者の遠心条件のほうが大きいという
ことになるのですか?優しい2ちゃんの先輩、教えてください。

867 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 18:38
なりません

868 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 18:47

> 単純に掛け合わせて

どうして「掛け」算にしようと思ったの???

869 :856:03/12/23 19:14
>863-864
抗体を精製タンパクに結合したかったんです。
TAP tag知らなかったです。勉強になりました。


870 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 21:10
いや、>>864>>863に対するツッコミね。protein A tagは昔から良く使われているし。そもそも>>865の言うとおりなんだよね。

871 :865:03/12/23 21:31
ワシ、動物細胞とかで発現させたりする系が多いんで培地に血清使う
場合、protein Aタグはあまししないから、、、、、

872 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/23 22:31
>>866
目安としてはrfcということになる
だが
落とそうとするものの比重や分子量や溶液の粘性などにより
計算通りというわけではない


873 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/24 02:03
あまししない?????

874 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/24 05:23
あまりしない、のことだろう。

875 :855:03/12/24 09:13
>>857
うーん、私へのレスですかね?
もちろん、PIPESは4.0ではつくれません。
HEPESはいうまでもありません。GOOD系は4.0なんて範囲
で使えないとおもうのですが・・・

酢酸系とかならまだしも・・・

876 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/25 16:21
>>847
kunkelは?

877 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/25 17:55
RNAプローブを合成するときには、T7、T3などのRNAポリメラーゼが結合するプロモーターが
合成用テンプレートに必要であると本に書いてありました。どのようにしてプロモーターを
連結させるのでしょうか?
また、DNAプローブを合成する時にはPCRしたテンプレートをそのまま使ってラベリングして
も大丈夫なのでしょうか?

878 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/25 19:20
きみはDNAを切り貼りするときどうするのか
それを考えればよかろう

879 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/25 19:43
>855
pH4.0だとあんまりないですよね.酢酸系じゃだめなんですか?

880 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/25 19:48
今ウェスタンブロットやっているんですが,サンプルにメルカプトいれてボイルしてもダイマーっぽい
バンドが出てしまいます(非特異ではなさそうです).どうやったらはがせますかね?


881 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/27 19:46
ウレア処理。

882 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/27 23:15
オレオレ処理


883 :あぼーん:あぼーん
あぼーん

884 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/30 02:11
>877
プローブはうまくできましたか?遅いかもしれませんが、
RNAプローブだったら
てきとーなベクターにTA cloningする。あなたの勉強のために以下省略。
DNAプローブだったら
クレクレノウをボルテックスさえしてなければまずできるでしょ。あなたの勉強のために以下省略。
まあ検出力はnon-RIのRNAプローブで十分でしょ。

個人的には878にはねられた後結果がどうなったか聞いてみたい。

885 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/30 02:31
>>884
ベクターにクローニングするより、
プロモーター配列をくっつけたプライマーで(以下略
の方が手軽だろうな。
S2細胞のRNAi関係のペーパーにやり方が載ってる。

886 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/30 06:32
RACEが上手くいかないYO!
Universal Primer mixたけで増えちゃうよ!
Nestedにすると何も増えないよ!
ホットスタートにしても何の効果もないよ!

最後の手段アニーリング温度をギリギリまで上げてみた

これでも上手くいかなかったらお手上げだよ!
キット高いし・・・ もう注文できないだろう・・・
断片とるまでは2ヶ月でいけたのに・・・


887 :880:03/12/30 08:51
>>881
私へのレスですよね.ありがとうございます.
ウレアは入ったまま泳動できるのでしょうか.除去してから?
今いるラボ,文献があまり取れないせいもありなかなかみつかりません.


888 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/30 12:15
   ☆彡■■■ 田中康夫はインチキの改革ゴロ ■■■☆彡
マスコミにない情報満載 田中康夫が恐れをなし、リンク拒否する「田中県政追撃コラム」
http://members.goo.ne.jp/home/tuigeki
菅直人は、田中康夫を大臣にだなんて言ってるけどオオ痛い!改革派だの市民派だのって言ってるけど、
あんなのぜんぜんインチキ、まるでダメ。「改革」をネタに売名してるだけの新タイプのゴロつきだね。
それに気付かない菅直人は大馬鹿。こんな具合だからいつまでたっても野党なんだ。
田中康夫は一ツ橋大学時代に学内誌の部費数百万円を横領して停学喰らい就職もフイ。プ〜タローして
いるときに書いた小説がたまたま、文藝賞の「なんとなくクリスタル」。ところが、受賞騒ぎで横領事件
が世間にバレルのでは?と受賞辞退までしていた、なんて知ってた?こんなのが大臣?
私は昔ロッキード事件なんてのを取材したこともある元記者で、こんな質問を会見で訊いたけどバックレ
られちゃって田中康夫の正体モロ見え。
この有様、長野県HP http://www.pref.nagano.jp/hisyo/press/20011228n.htm で確認できます。
今やってるのはメルマガだけど取材のほうはバッチリでマスコ゛ミの上を行く情報沢山出してます。長野県庁では大評判。
マスコミって言ったって、長野県辺りにいる連中はオイラから見れば出来の悪い大学生ぐらいにしか見え
ないんだけど、やってることは目茶苦茶でこんなんでよく・・・と今更ながら思う今日この頃。
うわべだけの田中康夫と、程度の低い新聞印刷会社の文案係が織り成す、ドタバタ長野県政物語を読
みたい方は読者登録の上お読みください、なんてね。みたい方は読者登録の上お読みください、なんてね。

889 :884:03/12/30 15:27
>>885
確かにおれっちもわざわざTA cloningなんてしてないんです。
簡便法はいくらでもありますよね。
初心者にはまずは基本を言った方が後学のためにも(以下略
と思いまして。

ところでプロモーター配列入れる方法って、
制限酵素サイト入りのプライマーでどのくらい余分な配列(いわゆる「足場」)を付けるか、
ってのと似たような不確定性を孕んでいるような気がするんですけど
まあうまくいくときはいくんでしょうね。

890 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/30 15:40
これだけかまわれてる887よ、その後どうなったんだ?
はやまって年末年始もしこしこ再実験か?先輩PDかDCにでも聞く良ろし。

891 :890:03/12/30 15:42
スマソ、887じゃなくって877だった…。
鬱…。

892 :名無しゲノムのクローンさん:03/12/30 17:36
>>884は知ったか


893 :877:04/01/01 17:41
>>884
ありがとうございました。クレクレノウって何ですか?
>>890
結局PCR産物をそのままラベリングしました。
電気泳動したところ本に載ってる写真みたいにはっきりでないでうっすらなんだけどいいのかな?
うちのラボは分子に詳しい人がいないので大変困ります。

ところで、参考にしている論文で使われているプローブはDNAプローブでした。
それなのにPCR産物をベクターでクローニングしたものをラベリングしているのですが、何故でしょう?
それとDNAプローブを作るときは、1本鎖のDNAをラベリングしなければならないらしいのですが、
加熱して一本鎖にすれば良いのでしょうか?




894 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/06 17:41
real-time PCRを使っているものなんですが、プラスミドからPCR産物のコピー数って
どのように計算したらいいのでしょうか?
どなたか知っていたらお願いします


895 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/06 17:46
ゲノムに複数のコピー数がある場合、その数で割らないといけない。
コピー数が不明、もしくはコピー数が1種類ではない場合は定量が困難。

896 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/06 17:50
894ですが、mRNAの定量を行っています
PCRで増幅されるのは一つですが…
蛍光強度からコピー数をだして発現量としている論文が多いのですが,
その蛍光強度からコピー数を求めるのが全然わかりません
調べてはいますが全然のっていなくてお手上げ状態です
よろしくお願いします

897 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/06 20:21
そりゃそのPCRの取説を読めば書いてあるんじゃない?

てゆか
学生さんって取り説読まないんだよねぇ



898 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/06 20:34
いんや
そりゃ蛍光で計ってるわけだから特別なキット使ってるでしょ
そのキットの取り説嫁ってことだ罠


899 :リコンビナント:04/01/06 23:38
タンパク精製うまくいかない・・発現量が少なくて・・なんでやろ??
GSTもHis6もFLAGもだめぽ。。少しずつコンストラクト変えてるのに。。
動いてる系も動かなくなってしまった。
やっぱタンパクによって条件とか全然違うんだね。
細胞が専門だけど、生化学の系でもみてみたくてやってるんだけど、
悪戦苦闘中。。
IPTGの濃度とか、インダクションの条件変えようかなぁ?
インクルージョンだったらちょっと面倒でつ(;;)

900 :リコンビナント:04/01/06 23:40
専門科求む!!ちなみにモノはあぽE

901 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/07 01:46
>>896
基準となるDNAからPCRした蛍光強度と比較してるってことでしょ。
で基準となるDNAのコピー数を重量からどうやって求めるかが
知りたいと。
6x10の23乗(個)が1モルから計算する。

だいたい3kbのプラスミド2マイクログラムが1pmol

902 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/07 06:08
内部標準だね
まあ,何でもモルで計算しないでもいいけどな.
どうせ論文にするときには,たとえば
熱ショック与えるとコンロトールの○倍(分の1)に
うp(down)レギュレートされた
とか書くんだろ?



903 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/07 06:37
スタンダードがPCR産物かプラスミドだとコピー数で出しにくいね。

904 :855:04/01/07 12:18
>>879
遅レス失礼。
解決しました。レスありがとう。
保存性見たかったので、浸透圧と成分は可能な限り均一にしたかったのです。
ちゃんと、人に教えてもらってちゃんと計測して作りました。

905 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/07 12:43
>900
タンパク質の精製2というスレがあるのでそこで聞いたら?
ちなみに発現量が少ない要因はたくさんある。

906 :900:04/01/07 23:40
>905さんありがとう!逝ってみ間酢。

907 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/10 19:12
バンドの濃さを内部標準のバンドの濃さでわるのって意味あるんですか?
単純にPCRのバンドの濃さで議論するよりはちょっとはましっぽいですが…

908 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/10 19:24
ライトサイクラーがあればいいのだが
どこのラボにもあるというわけではないだろから
competitor使って半定量的PCRやるか、ノザンだな。

909 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/10 22:42
定量目的もあるしFigureとして説得力ありそうなのでおれはのざん派。
のざんってみんなプローブなにでやってる?
おれは初心者らしくDig標識した非RI-RNAプローブだけど。
対象、発現量多いやつだけどバンドでるし、
ぜったいRI派って人はほんとにぜったいRIじゃなきゃだめなのか?

910 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/11 01:31
バンド出るならそれでいいと思う。RNAプローブで。
わたしもぜったいRI、な必要はないと思う。

911 :匿名:04/01/11 10:49
細胞膜の精製ってどこに注意すればいいですか?
収量が少なくって

912 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/11 12:54
********パチンコ店禁煙化へ署名協力お願いします!****************

http://www.mhlw.go.jp/getmail/getmail.html
@↑の厚生労働省のメール受付にアクセスして※マークのついた場所(内容以外)を記入してください。
(種別欄は「ご要望に」チェック、件名は「パチンコ店強制完全禁煙化の要望」でお願いします)
A↓の【 】欄全てに記入した後 ――― で囲まれた部分全てをコピーして内容欄に貼り付けてください。
B「内容確認」ボタンを押すと全ての記入内容が表示されますので、内容を確認した後「内容を送信する」ボタンを押してください。
ボタンを押したらメールの受付が完了します。


――――――――――――――――――――――――――――――
1)タバコの害
タバコには多くの発癌性物質、その他の有害物質が含まれていることは周知の事実であり、その被害は日本人の肺癌死亡者の甚大な数にもあらわれています。
2)パチンコ店の特異性
パチンコ店は同じ空間に非常に近い距離でほとんどの人が喫煙をするという状態にあり、しかも多くの人(大規模な店では数百人)が数時間に及んで同時に店内に居続けます。これは受動喫煙の被害を受ける世界中で最悪の環境といえます。
3)パチンコ店の自主的な禁煙化は困難
パチンコ店の顧客の多くは喫煙者であり、禁煙化は顧客の減少に直結します。全てのパチンコ店に平等かつ、顧客の減少を抑えて禁煙化を実現するには、行政が強制的に全国のパチンコ店に対し指導する必要があります。

以上の理由により、私は全国全店舗のパチンコ店の強制完全禁煙化に賛成し、迅速な対応を強く要望し、ここに署名します。
住所【 】氏名【 】ふりがな【 】年齢【 】性別【 】
――――――――――――――――――――――――――――――
******************************コピペ推奨*************************

913 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/11 13:42
出発原料をともかくたくさん確保すること。
それが不可能な実験はやめとけ。

914 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/12 13:41
>913
やっぱりそういうの大切ですよね…
実験動物とか実験始める前に欲考えないと。
ラボでやってるから漏れもやるのが当然と考えてしまって(以下略)


915 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/12 13:47
原料が多ければ、精製品も多くなる、これ基本。
原料の量を同じにして、収率をあげてプロダクト量を増やすのは
なかなか大変。
ラボに入りたての大学院生は、知識がないので、だましやすい、
とうちのボスはよく言っております。よい先輩や助手によく相談
してfeasibilityを考えてから行動しましょう。所詮大学院は自己責任。
しくじって、だめになるのは自分の人生。

916 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/12 13:50
>915
ありがたいお言葉ですゥ…

917 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/13 18:16
スレ違いだったらすみません。
脂質の同定法について知りたいのですが、薄層クロマトグラフィーで同定できないような比較的含量の低い脂質を同定するにはどうしたらいいでしょうか?
それと薄層クロマトグラフィーで分離できるようなリン脂質をさらに正確に定量する方法ってありますか?

よろしくお願いいたします。



918 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/13 18:26
http://2.csx.jp/~koukichi/tada.html

919 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/13 21:04
プラスミドを制限化(restricted; 制限エンドヌクレアーゼで切断すること)したんですが
ocDNAだけ見事にほぼ全量切れました(元のバンドは0%-定量誤差内)が
cccDNAは96%以上が切れません(Et-Br蛍光線量で定量しました)。
誤差があるので、おそらく全然切れていないといってよいと思います。
制限部位候補が一ヶ所だけの酵素を3種試しましたが、同様の結果です。
cccDNAを切りたい目的は置いといて
せめて1/3量くらいは切れるようにできないでしょうか。

920 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/13 21:10
ocが切れたことをどうやって定量すんの?
ocとリニアは同じ所に泳動されんじゃなかったっけ




921 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/13 22:17
>ocとリニアは同じ所に泳動されんじゃなかったっけ

なんでやねん

922 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/13 23:41
できることなら避けたかったのですが、one-hybridしなければいけません。
皆さんお使いのキットで良いものあれば教えてくださいな。
ん〜、はまりそうな予感です。。。

923 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/14 00:11
>917
液クロ

924 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/14 13:40
>917
基礎生化学実験法第5巻<脂質、糖質、複合糖質>日本生化学会編
東京化学同人などを参考にしたらいかがでしょうか?



925 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/14 18:57
>>920
移動度は

閉環状(cc(c))>開環状(oc)>線状(linear)

の順。

cccが切れないのは酵素が立体障害でアクセス不能なため。
したがって酵素処理前にある程度ほどく操作が必要。
ほどくためには


926 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/14 21:50
>>925
はあ?

閉環状(cc(c))>線状(linear) >開環状(oc)
の間違いでしょ。原理が分かれば間違えないはずなのにな。

それと立体障害云々も初めて聞いたな。



927 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/14 23:23
926の順になることが多いが925の順になることもあるし、
イコールになることもあります

928 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/15 01:53
>それと立体障害云々も初めて聞いたな。

おいおい

929 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/16 01:07
このまえいただいた抗体(うさぎちゃんのポリクロ)をHRP標識したら、
もともと数万倍希釈で使ってるらしいのにx1000以下の効力になってしまいました。
送られてきた抗体をHRP標識するときpH9.8にしたんですが、この状態でしばらく
置いといた、残り物のHRP標識してない抗体もやっぱx1000以下でした。
なんだかこわくてもとのPBSに溶かしてる、送ってもらった抗体、まだ
あらたに溶かしてはいないのですが、よく酸性条件下では抗体が失活すると
いいますが、pH 9.8とかだと、不安定になる抗体もあるんですか?
向学のためおしえてもらえたらうれしいです。
つうかSandwich EIA のコーティングも普通pH 9.5とかだよなあ。。


930 ::04/01/16 02:14
ブヒーー。 ブーー。 ブーー。ブッブブブッブブブッブブ
ブッブブブッブブ。ブヒーー。ブッブブブッブブブッブブ。
ブヒーーーーーーー。ブウ。.....ブウ。..............
ブ。ブ。ブ。


ブヒイイイイイイイイーーーーーーーーーーーーーーーーーーー!!!!


931 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/16 02:15
スペルミンやスペルミジンが良いんだっけ?

932 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/16 04:42
>>929
まずラベルしないで普通に使ってみた?
抗体、市販品で無い場合は乾燥状態にする過程で
力価がさがってることがある。

それから抗体の認識部位に活性基のC等がある場合、
力価の低下が予想される。

933 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/16 09:38
>>925 立体障害? cccとocで切れ方が違うのは、酵素によってhelicityの好き嫌いがあるからだが。

934 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/16 19:20
>>920
移動度は

閉環状(cc(c))>開環状(oc)>線状(linear)

の順。

cccが切れないのは酵素が立体障害でアクセス不能なため。
したがって酵素処理前にある程度ほどく操作が必要。
ほどくためには

935 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/16 22:30
  日  韓  断  交  !
平成13年3月31日に、『2015年までに 日韓断交を実現する会』を結成いたしますた。
【宣言文】韓国が嫌いな日本人の皆さん
  日本が嫌いな韓国人の皆さん 我々と協力し是非
  2015年までに日韓断交を実現しませんか?
お互い望むところです。
【入会方法】
  入会手続きは簡単。
  トリップを付けて、「入会します」と書き込むだけ。
  是非、これを機会に御入会を!
【名簿や資料、リンク集など】
  『2015年までに日韓断交を実現する会』NAVER JAPAN支部電子渉外局 NJ観測室
  http://f15.aaacafe.ne.jp/~book/
  http://www.geocities.co.jp/WallStreet-Stock/4433/
韓国 旅行要注意ーレイプーhttp://antiko.fc2web.com/
かえれ!竹島http://ime.st/www.perverts.nl/files/headfuck.mpeg



936 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/17 00:44
ほどくためには日韓断交か。

937 :919:04/01/17 10:20
>>934
ありがとうございます。
酵素で切れない件ですが、試した三種の酵素はそれぞれ
プラスミド(挿入含み)中でまったく別の物理的部位(結果的に
最も好ましくはマップ上で相互に120度離れています)に一箇所だけ
制限部位を持つものです。
そういうものを意図的に選びました。
cccDNAをほどくにはどうすればよいでしょうか。

938 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/17 21:30
cccDNAって電気泳動でどこに出てるの?

939 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/18 12:07
>>934 立体障害って、一体DNAをカチカチの棒か何かと勘違いしてないか?cccが切れにくかったり、逆にocが切れにくかったりするのは、螺旋のピッチの差に敏感な酵素があるからだよ。

940 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/18 16:22
ものすごく基本的なことで申し訳ないのですが、
FBSに含まれるエストロゲンってどの程度なんでしょうか。

例えば、basal mediumがフェノールレッドの入っていないものの場合、
10%FBSに含まれるE2は、10^-8M程度のエストロゲンと比べて
何倍、もしくは何分の一程度であると推測されるのでしょうか。
もちろん、ロットなどによって全く異なると思いますが、
目安として、ということです。

941 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/19 00:22
>>940

E2依存的に発現する遺伝子のプロモーター領域にluciferase
を繋いだコンストラクトを細胞にtransfectionし、
既知の濃度のE2を加えた時と、FBSを加えた時とで活性を比較する。
とかやってみたらいかが?

FBSはいろいろ入ってるからダメか?

942 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/19 14:17
TAクローニングが上手くいかない…
コロニー生えたと思っても、コロピーすると目的遺伝子が入ってない。
やっぱヒートブロックないのがいけないのかなあ?
それともベクターやコンピの扱いがいかんのか…?
はやくシークエンスしたいよ…

愚痴なのでsage

943 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/19 17:02
ファージをー20度で保存しちゃったけど、
プレートに撒いても生きてる?

944 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/19 21:31
>>942
そんな物posicon置けよ。一発で分かるじゃん。

>>943
タイターは下がるかも知れないけど、全滅ってことは無いと思う。が自信ない。

945 :940:04/01/19 23:40
>>941
ああそうか。
エスツロゲン受容体(ER)かなんかをtransfectionして、
プロモーターアッセイすればいいんだな。サンキュー




946 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/19 23:41
何のファージでどういう組成のバッファーに溶けてましたか?

947 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 01:05
λ、SM

948 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 01:32
数パーセントくらいに下がってると思う。増やしたクローンなら問題なし。ライブラリーならお気の毒。

949 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 09:34
944 :名無しゲノムのクローンさん :04/01/19 21:31
>>942
そんな物posicon置けよ。一発で分かるじゃん。

統べてコントロールとっても分からない事があった気がする、、、、。
TAクローニングじゃなく、ただのうつしかえで、、、、、。なんでだろうね?

950 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 10:33
TAべくたーを凍結融解するとてきめんにセルフらいげーしょんがでる

951 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 19:24
TAに限らずワンカットのベクターは
購入(調製)したらすぐに小分けして
当座の分以外は-80℃



952 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 20:08
そんなに分解されます?短期間で。

953 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 20:34
よくよめ。そういういみではない。

954 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 22:18
セルフが起きるって事??

955 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 22:55
>>950-951
どうして?
俺は−20度で保存しても問題なく使えてるけど。
自作vectorなら。TAも含めて。

956 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/20 23:06
TAは知らんけど、EcoRIもHindIIIもBamHIも5年前に調製したものをー20℃で保存して使ってるけど、気になるほどの劣化は認められません。>>951さんは何か勘違いをなさっているのではないでしょうか。

957 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/21 10:12
>>951
確かに、解凍を繰返すのはよくないですよね。どのレベルの実験環境(材料)を維持して
やっていくかの違いだけだと思いますが。おきそうなトラブルを減らしていく
事は、大事ですからね。

>>855,956
上記に海田阿戸でなんですが、私もお二方と同じで取り分け問題を感じた事はないです。

958 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/22 02:22
>>957にとっちゃあ、>>955>>956はスルーってことですか?正面から反論してるんだから、何か一言コメントがあって然るべきかと思うんですけど。

959 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/22 03:38
HPLCのカラムがおかしい。だれがやらかした。

960 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/22 12:08
>>955>>956はスルーってことですか?正面から反論してるんだから、
何か一言コメントがあって然るべきかと思うんですけど。

んっ?何か気に触っていたら済みません。
>私もお二方と同じで取り分け問題を感じた事はないです。
と書きましたが、この書き込みで何か気に触りましたでしょうか?

961 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/22 17:08
1.vec. only(ゲル精製了。以下これを使っている)
2.EcoRI処理vec.→ライゲーションせず
3.EcoRI処理vec.→ライゲーション
4.EcoRI処理vec.+導入断片(EcoRI処理済み1.5kbp)→ライゲーション

コロニーが出るのは1と3のみ。4は1:1,4,10,20と導入断片比を変えている
本EcoRIを使った他の組み替えは、問題なく可能。
すべて断片は、single cutのvec.でさえ、ゲルで精製。

組み替えができない原因は何ですか?

962 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/22 18:34
カットしたベクターをゲル精製する必要は無い。

963 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/22 21:03
>>961
dephosphorylationはしてないの?
ま、それは関係ないとして、
理論的に考えてインサートが悪さしてると結論づけられるね。

>>962
まあ必要ないけどバックグランドは下がるよ。

964 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/22 21:23
>>962.963
レスどうもです。

>カットしたベクターをゲル精製する必要は無い
100も1000も承知ですが、うまくいかなかったので、仕方がなくcut後
精製したまでです。通常はしません。

インサートは、TAcloning後別のfusionベクターに組み換えたものを更に別なベクタへ
移し替えをしようとした時にうまく入れ替えできませんでした。

要するに、うまくいかないベクターとの相性と言う事なのですか?

>dephosphorylationはしてないの?
勿論dephosphorylationしたものもしています。結果は同じですけど。

965 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/23 01:53
結果は同じですか。

966 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/23 09:17
>>965
>勿論dephosphorylationしたものもしています。結果は同じですけど。
のことについてのレスだと思いますが、言葉が足りませんね。

通常、vec. single cutはフェノクロ-エタチン後にdephosphorylation。
その後に、insertionとligationで大腸菌へ。
うまくコロニーがでなかったので961のようにしました。

勿論、コロニーがでない事には変わりはありません。

>理論的に考えてインサートが悪さしてると結論づけられるね。
たまに聞く話ですが、実際インサートが悪さして組み替えできなかった例って
皆さんもあるのですか?ほぼ似たベクターには入るのに入らないとか?

絶大なる経験者の方、誰か良きアドバイスをください!

967 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/23 13:16
伝説の短波長UVイルミネータを使ってるとか。

968 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/23 13:41
>>967
一応超波長です。他の物の組み替え時も、同じUVイルミネータ
を使っており問題が無いのですが、、、、。
何かこのvec.切り出しの時にやらかしてるのでしょうか?

969 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 04:17
EcoRIサイト(か周辺)に重要な遺伝子とか無いですよね、まさか。

970 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 04:30
ゲル精製した後エタ沈してるとか

971 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 13:13
>>969
>EcoRIサイト(か周辺)に重要な遺伝子とか無いですよね、まさか。
すみません。どう言う事だかイマイチ正確に把握できませんので推測でレス
します。EcoRIで切る事で、転写、もしくはプラスミドの複製に影響を与え
る領域が欠損叉はその領域にinssrtionが導入されると言った事は無いです


>>970
>ゲル精製した後エタ沈してるとか
これもよく分からなかったのですが、ゲル精製後はそのまま使っています。
エタチンするとよく無い事が起きるのでしょうか?個人的に、ゲル精製した
後に、その溶液をエタチンして再度滅菌水で溶解して使っても問題が無い気
がしますが

972 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 13:27
ligationがいっていないのか、ligationがいったのちに
できたベクターがtoxicになっているのか、そもそも
遺伝子の耐性とかをまちがえているのか。

973 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 14:40
>>972

今一度添付します

1.vec. only(ゲル精製了。以下これを使っている)
2.EcoRI処理vec.→ライゲーションせず
3.EcoRI処理vec.→ライゲーション
4.EcoRI処理vec.+導入断片(EcoRI処理済み1.5kbp)→ライゲーション
コロニーが出るのは1と3のみ。4は1:1,4,10,20と導入断片比を変えている
本EcoRIを使った他の組み替えは、問題なく可能。

添付してありますように、これを見ていただだければ、
>そもそも遺伝子の耐性とかをまちがえているのか。
と言う事は、無いと思います。

また、ligaseも問題ないと思います。

問題は
>ligationがいったのちにできたベクターがtoxicになっているのか、
と言う点ですが、たのベクターではサブクローニングできています。
たまたま、今回使おうと考えているベクターに入れる事で、毒性が発揮される
そんな事があるのでしょうか?ちなみに、極標準的な、論文でも多用されている
ベクターへの組み替えです。

974 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 15:37
insertのなかの遺伝子がプロモータ付きでたまたま
発現してしまい、そうなったplasmidをもつコロニーが
生えてこない(または生育が異常に遅くコロニーが
でていないようにみえる)ということは稀にあります。
対処法としてトラホメ後のプレートをLB1%Glcにするとか
逆に最小培地プレートにして25度でプレートをとるとか
というおまじないがあります
おまじないなので、常に効くとは限りませんが。

975 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 15:59
>>974
レスありがとうございます!

>insertのなかの遺伝子がプロモータ付きでたまたま発現してしまい
たまたまと言うのがみそなんでしょうか?他の類似のベクターでは発現しない
けど、この組み合わせがよく無いってことなんでしょうね?
promoter regionが入っていたのかな〜、、、、、。cDNAがpromoterとして
働くって言うものがたまにありますが、どうなんでしょうか?
結構これだと、色々都合が易い事があるんですよね。このmRNAを転写する
promoter regionには、いわゆる普通の転写因子結合領域が無くて未だに
転写寄稿が不明なのです、、、、。色々考えてみる価値はあるかな?

>LB1%Glcにする
そうですね。これはやっていないので、試してみようと思っていました。
やってみます。supressionかかればいいけど。と言うか、基本的にmRNAチェック
してませんから、いい加減な事言わない方がいいですね(w

976 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 16:00
訂正

誤:cDNAがpromoterとして

正:mRNA自身がpromoterとして

977 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 18:35
>> 973
とりあえず、insert が ligation しているかどうかを調べれば、
何かわかるのでないでしょうか?
insert 量がそこそそあれば電気泳導して insert が ligation したか
どうかはどうかは確認することができまするぞ。


978 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/24 18:48
>>977
おっしゃられる通りです。

実際、実行しています。ですが、本来導入すべくinsertどうしでしていません。
insertと別のfragmentどうしです。ligationされていました。
fragment同志でしたので、ligationは10度でo/nでしていますけど、、、。

やはり、本来のinsert同志でやってみた方が良いのでしょうか?

979 :977:04/01/24 22:47
>>978
やってみた方がよろしいかと思います。

私も他の vector だったら簡単に ligate するのに
何故か 自分が使用したい vector とはligation しないということがかってありました。vector の相性が悪いと全然 ligation しないようです。
私は、極力ゲル精製をしない、そしてゲル精製する際には、クリスタルバイオレットを使用して UV をあてないということで解決しました。
ちなみに、ligase は TOYOBO の ligation high が他の会社のものよりくっつきやすいみたいです。←別に TOYOBO のまわしものではないです。私が実際にやった際には他の会社ではくっつかなかったけどくっついたというだけのことです。

980 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/25 10:32
ベクターを代えるとサブクローニングできないことは良くあります。それほど
でなくても、one cutのベクターにサブクローニングしてもインサートが片方
向のものしか取れない(あるいは反対方向はきわめて増殖が悪い)ということ
は経験されたことがあるのではないかと思います。今のベクターを使いたいの
であれば、考えられる解決策は、上にあったようにGlc入りの培地を使う、形
質転換後の培養を30℃で行う、StratageneのABLE competent cellを使うなど
が考えられます。後者2つはいずれもプラスミドのコピー数を落とそうという
工夫です。

981 :名無しゲノムのクローンさん:04/01/25 12:38
>>977
>私も他の vector だったら簡単に ligate するのに
>何故か 自分が使用したい vector とはligation しない
皆さんも苦労しているのですね、、、。クローニングって、
もはやルーチンワークで”誰でもできる”見たいな風潮
があるので、他の組み換えは問題なくできるのに、one cut
の組み換えでつまずくと結構凹みますね、、、、、

>ligase は TOYOBO の ligation high が他の会社のもの
>よりくっつきやすいみたいです
以前はtakaraのligation hightを使っていましたが、今は
TOYOBO の ligation highを使っています。安いからと言
う、理由なんですけど(苦笑)

>>980
>one cutのベクターにサブクローニングしてもインサートが片方
>向のものしか取れない(あるいは反対方向はきわめて増殖が悪い)ということ
>は経験されたことがあるのではないかと思います。
これは確かにありますね。確率では、正逆等比で出てきてもおかしくないのに
実際は偏りがある事が多いです。

>上にあったようにGlc入りの培地を使う、形 質転換後の培養を30℃
>で行う、StratageneのABLE competent cellを使う
取りあえず前者2つはすぐにでも実行に移せれるので、やってみます。

本当に多くの方に御指示頂き、ありがとうございます!

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